豬帶絳蟲乳酸脫氫酶基因的序列分析、克隆表達和免疫學分析*

杜武英,黃 江,胡旭初,余新柄,徐 勁 ,廖興江,戴佳琳

豬帶絳蟲為世界性分布,成蟲寄生于人體腸道引起豬帶絳蟲病,幼蟲寄生于人體皮下、肌肉或內臟引起囊尾蚴病〔1〕。在我國,豬帶絳蟲病與囊蟲病分布及流行態勢多呈片狀分布,且青壯年發病率較高,少數地方近年來兒童囊蟲病有上升趨勢。本課題組近年來從豬帶絳蟲基因組及蛋白質組學的研究入手,系統地開展豬帶絳蟲基因的鑒定和功能研究。我們從豬帶絳蟲成蟲全長cDNA文庫中克隆了一個乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的同源基因,力圖通過對該基因及其編碼的蛋白結構和特征進行全面的生物信息學分析,以指導該基因的克隆表達、重組蛋白的純化及免疫學特性的初步研究,從而為其生物學功能研究及其在診斷、藥物及疫苗方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬帶絳蟲成蟲蟲體標本 采自四川甘孜州雅江縣,豬帶絳蟲成蟲全長cDNA質粒文庫由北京華大基因研究中心構建,大規模測序得到多個表達序列標簽(expressed sequence tag,EST)、利用美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站的基本局部比對搜索工具(basic local aligment search tool,Blastx,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)歸并EST獲得Unique Gene(Unigene)由本課題組與上海英駿生物公司合作完成。編碼豬帶絳蟲成蟲LDH基因文庫質粒編號為0_001458。

1.1.2 質粒,菌株 原核表達質粒pET-28a(+)和大腸桿菌BL-21/DE3由中山大學醫學院病原生物學實驗室保存。

1.1.3 感染豬帶絳蟲豬血清 由貴陽醫學院寄生蟲學教研室提供,病人血清采自豬帶絳蟲流行區。

1.1.4 主要試劑和工具酶 NcoⅠ,XhoⅠ,T4 DNA連接酶,DNA標準(DL2000)均購自自TaKa-Ra公司;Ex Taq酶(含 dNTP)和異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG),購自美國Promega公司;Ni-IDA Agarose(cat No:69670)購自美國Novagen公司;蛋白分子量標準購自立陶宛MBI公司;DNA凝膠回收試劑盒,質粒純化試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的數種二抗和DAB(3,3二氨基聯苯胺)顯色試劑盒均購自武漢博士德有限公司;PVDF膜購自Millipore公司;TMB顯色試劑盒購自美國BD公司;SDS等試劑均購自上海申友生物科技公司。

1.1.5 引物合成和DNA測序 基因擴增引物和重組質粒DNA測序由Introvigen上海生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Ts LDH-A基因的識別及其推導氨基酸序列的生物信息學分析 通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站的基本局部比對搜索工具(basic local aligment search tool,BlastX,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)程序,將文庫質粒編號為0_001458的插入序列與GenBank中的序列進行比對分析;利用Vector NTI suite軟件包推導基因的開放閱讀框和氨基酸序列;利用通過瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(Expert Protein Analysis System,ExPASy,http://ca.expasy.org/)、IEDB Analysis Recource(http://tools.immuneepitope.org/main/jsp/menu.Jsp)提供的分析工具分別預測分析蛋白質的理化性質、一級、二級結構等,以及利用 3D-PSSM對蛋白質的空間構象建模。

1.2.2 Ts LDH-A基因的的克隆表達 Ts LDHA基因的擴增:根據已獲得的Ts LDH-A編碼序列,利用DNAClub和PCRdesign設計引物:

以豬帶絳蟲成蟲cDNA文庫中Ts LDH-A基因的克隆質粒為模板,通過 PCR擴增,回收擴增產物。

重組原核表達質粒(pET-28a(+)-Ts LDH-A)的構建及鑒定:將PCR產物和原核表達質粒pET-28a(+)經 Nco I和Xho I雙酶切后回收、連接,轉化入大腸桿菌BL-21/DE3感受態細胞,卡那霉素篩選陽性克隆。對陽性克隆提取質粒進行PCR、雙酶切和測序鑒定。

Ts LDH-A基因在大腸桿菌BL-21/DE3中以IPTG誘導表達后,離心收集菌體,制備成電泳樣品并進行SDS-PAGE電泳分析。

Ts LDH-A基因在大腸桿菌BL-21/DE3中的大量誘導表達和純化:對陽性克隆進行大量誘導表達,離心收集菌體、超聲裂解后離心收集上清并過濾,參照Ni-IDA Agarose說明書進行蛋白純化,收集蛋白洗脫液,SDS-PAGE電泳分析目的蛋白。將洗脫的目的蛋白在0.15mol/L的PBS(pH7.9)透析液中4℃透析24h。透析后的蛋白-80℃凍存備用。

1.2.3 動物免疫實驗 用純化的重組蛋白以腹部皮下多點注射方式免疫SD大鼠,共免疫3次,于末次免疫后2周剪尾采血,分離血清。

1.2.4 Western Blotting檢測重組蛋白的免疫學特性 將純化的蛋白進行SDS-PAGE(12%)電泳,使用電轉移儀于100V冰浴轉印1h,將蛋白轉移至PVDF膜上。一抗分別為重組蛋白免疫的SD大鼠血清、感染豬帶絳蟲的豬血清、感染豬帶絳蟲病人血清、亞洲帶絳蟲病人血清和感染牛帶絳蟲病人血清(1∶100稀釋),二抗相應為辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠IgG、山羊抗豬IgG和兔抗人IgG(1∶2 000稀釋)。DAB顯色至出現目的條帶,超純水終止反應。

2 結 果

2.1 Ts LDH-A的生物信息學分析結果

2.1.1 編號為0_001458文庫質粒的插入序列的Blastx分析 從BLASTX的分析結果來看,該基因是乳酸脫氫酶A的同源基因,與GenBank中其他物種同源基因的氨基酸序列的一致性為54%左右。從比對結果來看,該克隆基因的5′端序列長于其他物種完整的乳酸脫氫酶編碼序列,該基因應該是豬帶絳蟲A型乳酸脫氫酶的全長基因序列,其最大的ORF就是其完整的編碼區。Rpsblast分析發現其有乳酸脫氫酶的保守結構域。

2.1.2 Ts LDH-A蛋白質的理化性質、翻譯后的修飾位點及亞細胞定位ExPASy中ProtParam預測Ts LDH-A的理論分子量和等電點分別是35 461.1 Da和7.09。含有9個半胱氨酸,彼此之間形成二硫鍵可能性小。在溶液中的不穩定指數為25.56,低于域值40,蛋白性質較穩定;脂肪族指數105.05,總親水性0.239。PROSCAN分析特定位點結果顯示:Ts LDHA含有5個潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點;有3個潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點,有1個酪氨酸激酶(PTK)磷酸化位點;7個潛在的N-肉豆蔻酰位點;有1個L-乳酸脫氫酶活性位點,位于189-195位氨基酸。TargetP預測 Ts LDH-A無信號肽序列,無線粒體、過氧化酶體、溶酶體和細胞核等定位序列。

2.1.3 Ts LDH-A一級結構中包含的結構和功能域特征序列 ExPASy中InterPro Scan掃描結果顯示該氨基酸序列中含有2段乳酸脫氫酶保守功能域,分別位于N端和C端;在189aa-195aa具有酶的活性位點。

2.1.4 Ts LDH-A的拓撲結構和二級結構 Ex-PASy中PredictProtein分析蛋白的拓撲結構和二級結構,該蛋白有三個跨膜區(圖1),蛋白所含的9個半胱氨酸之間都未形成二硫鍵。Sec預測α螺旋(H)、β折疊(E)和無規卷曲(L)的比例分別是36.25∶22.05∶41.69。

圖1 Ts LDH-A的拓撲結構、二級結構圖Fig.1 The topology,secondary structure of Ts LDH-A by Predictprotein

2.1.5 Ts LDH-A的抗原表位分析 IEDB Analysis Resource中B Cell Epitope Prediction Tools分析預測Ts LDH-A的B細胞抗原表位結果顯示,該氨基酸序列中有4個主要的表位:13aa-20aa(GSRHGHEP),190aa-199aa(GEHGDSSVPV),215aa-228aa(PKIGQAGDPDDFAS),307-314aa(FSPSEKQS)。

2.1.6 Ts LDH-A的三維結構及線性表位和活性位點的位置 ExPASy中3D-pssm(Phyre Version 0.2)將Ts LDH-A與蛋白結構數據庫中的蛋白質三維結構進行匹配,通過二級結構比對和折疊,模建Ts LDH-A的三維結構圖。圖中4個黃色區段代表B Cell Epitope Prediction Tools預測的4個主要B細胞抗原表位,其中表位 190aa-199aa(GEHGDSSVPV)中包括LDH活性位點組氨酸(His192,H)。結合其它同源基因的相關實驗研究〔2-4〕,將另兩個LDH活性中心氨基酸精氨酸(Arg105,R)和天冬氨酸(Asp165,D)也標注其上。3個關鍵氨基酸在二級結構上相距甚遠,但在空間結構中相互靠近,構成酶的活性中心(圖2)。

圖2 Ts LDH-A的3D結構、潛在抗原表位和關鍵氨基酸的空間位置Fig.2 The 3D structure of Ts LDH-A and the spacial localization of four possible epitopes and key aminoacids

2.2 Ts LDH-A基因的的克隆表達

2.2.1 原核重組質粒的鑒定 將重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定,產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。圖3中第2泳道是PCR產物,第3泳道是雙酶切鑒定結果,在1000bp左右有一清晰的條帶,與目的基因的大小基本相符,證明重組質粒構建成功。

圖3 pET28a(+)-Ts LDH-A重組質粒的雙酶切鑒定(1.0%瓊脂糖凝膠電泳)Fig.3 Identification of pET28 a(+)-Ts LDH-A by with enzymes digestion

2.2.2 蛋白表達純化結果 將構建好的重組質粒轉化到E.coli BL-21/DE3中表達,SDS-PAGE電泳分析結果如圖 4中第 4、5、6泳道所示,大約在36kD左右處出現表達條帶,與目的蛋白分子量基本相符,說明蛋白既有可溶性表達,也有包涵體表達。純化后蛋白位于圖中第7泳道,其位置與目的蛋白相符,證明目的蛋白純化成功。測得純化產物的蛋白濃度為0.7mg/mL。

圖4 pET28a(+)-TsLDH-A原核表達及純化產物的12%SDS-PAGE分析Fig.4 12%SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression and purification products of pET28a(+)-TsLDH-A

2.2.3 Western Blotting鑒定 Ts LDH-A重組蛋白 將純化好的重組蛋白分別與重組蛋白免疫的SD大鼠的抗血清、感染豬帶絳蟲的病人血清及感染豬帶絳蟲的豬血清相互作用后,結果如圖5所示,在36kDa左右均可見一明顯的免疫反應條帶(1、3、5泳道),大小與重組蛋白預測的分子量相近,而陰性對照血清在相應的位置均未識別出該條帶。

3 討 論

多數體內寄生蟲的能量主要源于無氧糖酵解,而乳酸脫氫酶(LDH)是糖酵解途徑的末端酶,在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的輔助下,催化丙酮酸還原為乳酸及乳酸氧化為丙酮酸的可逆反應,被認為是影響寄生蟲能量代謝重要的酶類之一〔5〕。

LDH是一同功酶家族,動物和人的LDH是以4個亞單位組成的四聚體寡聚酶的形式發揮作用的,其中由A、B兩個亞基組成的同功酶具有明顯的種屬特異性和組織特異性并與其生化表現型和生理功能相適應〔6-9〕,近年的研究還表明LDH的表達還可能與細胞周期等有關〔10-12〕。因此對LDH同工酶基因的研究不僅可以區別物種間的遺傳差別和進化特征,而且可為動物或寄生蟲個體發育過程中基因表達和調控研究提供良好的模式。既往對于蠕蟲LDH的研究較少。血吸蟲和華支睪吸蟲 LDH分子結構與功能的研究提示LDH既是一個有潛力的診斷和疫苗候選抗原,又是吡喹酮、蒿甲醚等重要的抗寄生蟲藥物作用靶點之一,也是研究生物種系進化較好的指標分子〔2-3,13-16〕。本課題組近年來對亞洲帶絳蟲成蟲LDH基因的研究結果也提示,Ta LDH基因是一有潛力的疫苗候選抗原或藥物作用靶標〔4,17〕。以上相關理論及實驗結果表明,研究比較三種人體帶絳蟲(豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲)的乳酸脫氫酶及其同工酶家族成員的結構與功能具有重要的理論意義和應用價值。

圖5 pET28a(+)-TsLDH-A重組蛋白的 Western blotting分析Fig.5 Westen blotting analysis of the pET28a(+)-TsLDHA recombinant

本研究首先從課題組構建的豬帶絳蟲成蟲cDNA文庫中篩選出編號為0_001458文庫質粒,經NCBI網站Blastx在線分析,該質粒的插入序列編碼的氨基酸序列與GenBank中其它物種的A型乳酸脫氫酶同源性可達到54%左右,并具有完整的乳酸脫氫酶保守功能域,推測該質粒插入序列為豬帶絳蟲乳酸脫氫酶A的編碼序列,該序列含有完整的開放閱讀框,是一個全長cDNA序列。預測其編碼的蛋白相對分子量理論值是35 461.1Da,理論等電點為7.09,蛋白的理化性質較穩定。

其次,根據以上分析的理論結果,本研究應用原核表達載體 pET28a(+)對 Ts LDH-A進行亞克隆,轉化入大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導表達。PCR、雙酶切及DNA測序結果均表明重組質粒pET28a(+)-T s LDH-A構建成功。將融合表達和純化的產物行SDS-PAGE電泳分析,結果顯示目的條帶分子量與預測值基本一致,表明重組蛋白得到了表達并且純化成功。Western Blotting結果表明純化蛋白能被重組蛋白免疫的SD大鼠血清、感染豬帶絳蟲的病人血清和豬血清識別,說明重組蛋白在純化后具有較好的免疫原性和免疫反應性,提示Ts LDHA可能是一潛在診斷抗原。

再次,生物信息學分析預測還提示Ts LDH-A有3個跨膜區,沒有線粒體、過氧化酶體、溶酶體和細胞核等亞細胞定位序列。結合LDH在其它絳蟲的組織定位和特性,如韓國學者發現曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansoni,Sm)LDH在成蟲及裂頭蚴的皮層及皮下肌層活性最高〔18〕、本課題組的免疫組織化學結果顯示亞洲帶絳蟲LDH重組蛋白定位于成蟲的表膜和蟲卵的胚膜〔17〕,我們推測 Ts LDHA可能在豬帶絳蟲成蟲的表膜上分布較多,而分布在表膜的蛋白則有可能為藥物的靶分子,或是診斷抗原的候選分子。拓撲學分析發現酶催化中心的組氨酸殘基(His192)位于潛在的 B細胞抗原表位序列190aa-199aa(GEHGDSSVPV)中,由于 His192是酶活性中心的關鍵氨基酸,特異性抗體如與之結合,His192就不能正常行使其在酶促反應中的功能,從而會影響整個酶的活性,在宏觀上可表現為酶促反應受到抑制。由此又可以推斷Ts LDHA特異性抗體可能結合蟲體表膜上 LDH的抗原表位,這種結合可能會抑制酶的活性、影響到蟲體的糖代謝,因而從這一角度分析 Ts LDH-A也可能是一個重要的藥物靶標。同時,Ts LDHA分子暴露在蟲體表膜上使它可能成為免疫攻擊的靶點,介導補體的殺傷作用、抗體的ADCC作用和細胞免疫攻擊,因此Ts LDH-A還可能是一個疫苗侯選分子。

比較已有的寄生蟲 LDH的研究進展,綜合本研究的生物信息學預測理論、實驗結果及合理的分析推測可知,對豬帶絳蟲A型乳酸脫氫酶基因的克隆、表達及可溶性重組蛋白的純化,能夠為進一步研究該基因的生物學功能以及在診斷、疫苗研究方面的作用奠定基礎,可以為區別物種間的遺傳差別和進化特征提供線索,甚至有可能在三種人體帶絳蟲個體發育過程中基因表達、調控的研究和分類關系方面給我們一定的啟示。

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