亞洲帶絳蟲感染動物模型的研究進展*

謝 暉,楊亞明,2

亞洲帶絳蟲(Taenia asiatica)或稱亞洲牛帶絳蟲(Taenia saginata asiatica)是1988年由范秉真氏在臺灣首先報道,故稱之為臺灣帶絳蟲(Taenia taiwanensis)〔1〕。自上世紀 70年代以來,范秉真先生等在臺灣高山族居民中調查證實,當地流行的牛帶絳蟲病病原體為亞洲帶絳蟲,人群的感染率達11%(3 104/27 359)〔2-3〕。之后 ,該絳蟲種又分別在云南、貴州等省及泰國、韓國、新加坡、印尼、菲律賓等地區發現,且屬于亞太地區帶絳蟲的優勢蟲種。引起這種絳蟲流行的主要因素是與這些國家或地區的居民多喜生吃牛、豬及野生動物(如野豬、熊等)的肉或內臟(肝臟)習俗密切相關,如我國臺灣高山族地區和廣西三江居民都有這種習俗〔2,4〕。

迄今亞洲帶絳蟲的正確分類地位仍未解決,是屬于獨立的新種還是牛帶絳蟲亞種,許多學者曾為此開展了大量的研究。通過實驗觀察,亞洲帶絳蟲其成蟲形態與牛帶絳蟲相似,但其囊尾蚴主要以豬作為中間宿主,3種絳蟲生活史及外部形態方面的比較見表1。

表1 亞洲帶絳蟲與牛帶絳蟲和豬帶絳蟲的形態和生活史區別

在國外,Zarlenga等(1991)應用PCR連續擴增技術等從臺灣株亞洲帶絳蟲中提取核糖體DNA片段,采用限制性內切酶消化和Southern印漬法,比較牛帶絳蟲和豬帶絳蟲基因差異;并采用32 P標記全部RNA,且用克隆的核糖體RNA(rRNA)基因片段作為探針進行研究,發現臺灣株亞洲帶絳蟲的DNA雜交模式與豬帶絳蟲明顯不同;而與亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲中克隆的核糖體基因片段的限制性內切酶圖譜卻很相似,雖然亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲rDNA重復序列間非轉錄區域—內含子(NTS)長短不同,但是兩者的 rDNA NTS序列卻相同〔5〕。此后,Bowles從遺傳學的密碼簡并性來研究亞洲牛帶絳蟲的分類地位時,也發現其與牛帶絳蟲的線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ(CO Ⅰ)和核中rDNA28s的順序十分接近〔6〕,以上研究提示從分子遺傳學上亞洲帶絳蟲與牛帶絳蟲屬于不同的蟲種,但兩者的親緣關系較近。

由于亞洲帶絳蟲在東亞和東南亞許多國家地區廣泛分布,在我國大陸云南、廣西和貴州呈局部流行,其成蟲寄生人體引起的癥狀主要為腹痛、腹瀉、惡心嘔吐等消化道癥狀及頭痛、頭暈、嗜睡、皮膚瘙癢等神經方面的癥狀。為了更清楚亞洲帶絳蟲的形態結構、分子水平結構和各個時期的不同抗原成分以及入侵機制、致病機理、免疫機制和宿主特異性等基礎理論和相關臨床應用,對于建立該蟲動物模型開展以上方面的研究具有重要的作用,40多年來國內外許多學者在這方面的研究取得了一定的進展。現將其動物模型研究進展進行綜述。

1 感染家豬動物模型情況

豬是豬帶絳蟲和亞洲帶絳蟲自然中間宿主,為適宜的實驗動物。范秉真等〔7〕曾以亞洲帶絳蟲蟲卵經口注射給14只小耳微小豬(Small-Ear-Miniature(SEM))、19只長白種小耳微小豬(Landrace-Small-Ear-Miniature(L-SEM))和 5只杜羅克豬(Duroc Yorkshire Landrace(DYL)),經過 7～10d后處死后發現其中有34只感染亞洲帶絳蟲,以上3種動物感染率分別為 86%(12/14)、89%(17/19)和 100%(5/5);而且發現感染囊尾蚴的部位只在肝臟,其他部位均無發現,這與亞洲帶絳蟲六鉤蚴僅通過靜脈循環移行到肝臟并在此發育成熟有關。之后,汪敏和莫興澤等也先后以貴州株亞洲帶絳蟲孕節直接灌喂感染當地圈養的健康約克種乳豬,在豬的肝臟內發現了大量囊尾坳。此外,貴州的李博〔8〕等采用都勻株亞洲牛帶絳蟲孕節灌喂健康乳豬,分別于感染前感染后20、50、75d抽血,比較γ-谷氨酰胺轉移酶(γ-GT)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖苷酶(NAG)、乳酸脫氫酶(LDH)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)和α 1抗胰蛋白酶(α 1-AT)、前白蛋白(PA)等酶的變化,結果感染75d的乳豬與感染前相比,除前白蛋白(PA)下降了6%外,上述酶含量分別提高了320%、157%、191%、950%、21%、212%、1 307%,這些生化指標說明感染宿主的肝臟因感染囊尾蚴受到損傷。令狐艷等學者的研究結果也表明亞洲帶絳蟲囊尾蚴致使豬肝臟的病理變化較為顯著。這些結果表明亞洲帶絳蟲對豬的感染率較高,感染部位主要在肝臟。

對于建立豬動物模型的感染方式認為以蟲卵或節片經口感染方式是人工感染豬為常規方法,但感染需要大量的蟲卵,而且難以預料感染囊尾蚴的數目。這與豬帶絳蟲感染豬建立動物模型的方式有所不同,后者多采取六鉤蚴直接注射到豬的肌肉而感染,亞洲帶絳蟲六鉤蚴能否與之類同,則未見報道。

盡管豬對亞洲帶絳蟲易感,但不同研究結果也顯示,豬的種類對于感染該絳蟲具有一定的差異,范秉真氏等〔7〕分別采用來自臺灣、韓國等亞洲牛帶絳蟲蟲卵經口喂給小耳微小豬(Small-Ear-Miniature(SEM))、長白種小耳微小豬(Landrace-Small-Ear-Miniature(L-SEM))和杜羅克豬(Duroc-Yorkshire-Landrace(DYL)),3種豬的感染率(囊尾蚴檢出率)分別為臺灣株88%(19.1%),83%(1.1%),100%(0.3%),韓國株 100%(1.7%),100%(5.6%),100%(0.06%)。

2 感染鼠動物模型的建立

盡管豬是亞洲帶絳蟲最適宜的實驗動物,但由于其個體大,不便管理和操作,為此一些學者開始尋找小型實驗動物模型。1994年,ITO.A〔9〕等首先用有嚴重聯合免疫缺陷病(SCID)小鼠為實驗對象,從背部皮下注射亞洲牛帶絳蟲六鉤蚴,成功地獲得成熟的囊尾蚴,囊尾蚴的大小接近典型牛帶絳蟲,且經5個月全部囊尾蚴仍存活。但發現其時的絳蟲囊尾蚴原頭節上無小鉤;而范秉真等也用SCID小鼠建立了該蟲的實驗動物模型,用39 000只亞洲牛帶絳蟲六鉤蚴灌給10只SCID鼠,經過38～244d后,所有實驗老鼠的皮下組織都檢及了囊尾蚴,且有發育不良的小鉤〔10〕,這兩個實驗在囊尾蚴是否有小鉤上出現了不同結果,是否為亞洲帶絳蟲不同地理株間的差異,還是不同感染方式引起囊尾蚴不同發育期小鉤退化尚需進一步觀察。之后Ito等(1997)〔11〕又將體外孵化的取自韓國和臺灣的亞洲牛帶絳蟲六鉤蚴經腹腔接種SCID鼠,4個月后在所有雌性SCID鼠的腹腔內和背部皮下檢及大量的活囊尾蚴,比經口服感染1-2個月后的豬肝上得到已鈣化的囊尾蚴還要大;但同步進行感染的雄性SCID鼠卻全部陰性,究其原因有待進一步探討。雌性SCID鼠可作為亞洲帶絳蟲比較好的囊尾蚴動物,容易感染的因素主要與該鼠體內缺乏功能性 T淋巴細胞及B淋巴細胞,難以抵抗六鉤蚴的入侵和較容易發育成囊尾蚴〔9〕。

但由于SCID鼠昂貴而且嬌弱,飼養條件要求高,難以廣泛應用。為此,一些學者對小鼠進行反復試驗,發現昆明小鼠是較理想的動物模型,尤其是經免疫抑制的小鼠。如Wang IC等〔12〕用亞洲牛帶絳蟲六鉤蚴靜脈注射給業經免疫抑制的ICR和C57小鼠均獲成功,前者感染率 12.5%,后者達到100%;陳利紅等(2005)〔13〕用活化的都勻亞洲帶絳蟲六鉤蚴對昆明小鼠分別進行皮下注射、腹腔注射、灌喂3種途徑感染,同時用地塞米松(1mg/d)皮下注射對小鼠進行免疫抑制,感染 30d、40d、50d、60d后分別剖檢,上面三種方式感染率分別為46.7%,20%和0。以上實驗也說明采用免疫抑制小鼠可在某段時間里替代SCID小鼠作為替代動物模型。

人是亞洲帶絳蟲的自然終宿主,為尋找實驗替代終末宿主,學者做過許多動物實驗。2006年Chang SL等〔14〕報告了蒙古沙鼠,先用臺灣亞洲帶絳蟲蟲卵經口感染蒙古沙鼠,48w后從鼠體內檢出囊尾蚴再以口服方式灌飼11只蒙古沙鼠(為減輕應激反應予潑尼松龍免疫2.5-5mg/次,從感染前5d到感染后9d共2w),感染后第14d處死全部實驗鼠,結果在5只鼠的小腸前段部分檢及6只亞洲帶絳蟲成蟲,沙鼠感染率和絳蟲檢出率分別為45%,27%;證實了沙鼠既可以作為亞洲帶絳蟲實驗感染中間宿主,亦可為其實驗感染終末宿主。

3 其他感染動物模型

戎聚全〔15〕等以都勻株亞洲帶絳蟲孕節灌喂荷爾斯坦乳牛1頭,62d后剖檢,在肝臟中檢及成熟囊尾蚴,但幼蟲周圍組織病理變化較輕。范秉真〔16〕也觀察到亞洲牛帶絳蟲可感染牛,囊尾蚴僅分布在肝臟。囊尾蚴原頭節上都有兩圈發育不良的小鉤。此外,范秉真等還分別采用來自臺灣、韓國、印尼、泰國、菲律賓和緬甸的亞洲牛帶絳蟲孕節或卵對荷爾斯坦乳牛(Holstein calves)、羊(Sannean goats)及臺灣猴、兔、狗、和貓等作感染實驗,發現牛、羊和猴均可被感染,其中,感染臺灣亞洲帶絳蟲的荷爾斯坦乳牛、羊及臺灣猴感染率和囊尾蚴檢出率分別為100%(1.1%)、33%(0.01%)和 50%(0.01%);而感染韓國株亞洲帶絳蟲的荷爾斯坦乳牛、羊感染率和囊尾蚴檢出率分別為 100%(0.03%)和50%(0.02%);并發現在上述動物中亞洲帶絳蟲囊尾蚴只有在牛體內能發育成熟,其余動物的體內都鈣化或退化,說明只有牛可作為該絳蟲的囊尾蚴感染動物模型〔4,16〕。

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