MDM2-P53反饋調節對大腸癌作用的臨床病理學研究

成志強 王曉玫 單軍 高利昆 許靜 彭全洲 胡錦濤

1.深圳市人民醫院病理科，廣東 深圳 518020 2.深圳市人民醫院放射科

MDM2-P53反饋調節對大腸癌作用的臨床病理學研究

成志強1王曉玫1單軍2高利昆1許靜1彭全洲1胡錦濤1

1.深圳市人民醫院病理科，廣東 深圳 518020 2.深圳市人民醫院放射科

目的 分析MDM2基因擴增、P53基因缺失與蛋白異常表達在大腸癌發生演進中的作用、與臨床病理因素的關系。方法 應用RT-PCR、FISH和免疫組化技術，檢測72例大腸癌組織MDM2基因擴增、p53基因缺失以及其蛋白表達特點。結果 大腸癌MDM2基因擴增、p53基因缺失率為28.1%和53.1%，兩蛋白表達陽性率為43.0%和65.0%。MDM2、p53蛋白在肝轉移、淋巴結轉移組中表達明顯增多，與對照組比較差異有顯著性(P=0.011)；p53基因缺失、MDM2基因擴增在有靜脈侵襲大腸癌組明顯高于無靜脈侵襲組（60.7%和31.8%），MDM2蛋白表達與癌細胞對靜脈侵襲性有關（P =0.016）。 結論 MDM2、p53基因參與大腸癌發生發展過程，MDM2在肝轉移組、靜脈侵襲組表達明顯增多，可作為肝內微小轉移的參考指標, MDM2、p53蛋白表達與淋巴結轉移、肝轉移有明顯相關性，提示預后不良，兩基因聯合檢測對大腸癌預后評估有重要意義。

MDM2癌基因；p53抑癌基因；大腸癌；熒光原位雜交； RT-PCR

大腸癌是嚴重危機人類健康的常見惡性腫瘤之一，近年發病率呈明顯上升趨勢。雖然治療技術不斷改進，但預后較差，究其原因是患者就診時已經發展到疾病的中、晚期，腫瘤的高侵襲力與高轉移能力是致死的主要原因，探究大腸癌發生發展機制、尋求判斷患者預后的有用指標,是國內外學者關注的熱點。MDM2是成瘤性很強的新癌基因，位于染色體12q13-14，其蛋白產物p 90能與野生型p 53蛋白結合使其失活或功能抑制，腫瘤細胞逃逸p 53基因對生長調控作用，導致細胞異常增生。MDM2- p 53反饋調節環路在軟組織肉瘤、膠質瘤、食道鱗癌和乳腺癌等腫瘤的發展中起重要作用[1-2]，然而對大腸癌組織MDM2基因擴增與表達的研究甚少，對MDM2-p 5 3反饋調節環路對大腸癌致癌機制以及與臨床病理因素的關系仍不清楚。

本實驗運用RT-PCR、FISH、免疫組化技術檢測人大腸癌標本MDM2基因擴增、P53基因缺失與蛋白表達，探討MDM2、p 5 3基因異常與大腸癌發生發展、腫瘤浸潤、轉移能力等臨床病理因素的關系，試圖了解MDM2-p53反饋調節環路在大腸癌發生發展的作用，尋找判定大腸癌患者預后的生物學標志物。

1 材料和方法

1.1 材料 收集我院手術切除大腸癌標本共72例, 標本經40g·L-1甲醛固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋制片（表1, 其中32例為術后30分鐘內迅速將新鮮大腸癌標本液氮冷凍，并保存于-80℃低溫冰箱），進行FISH、免疫組織化學和RT-PCR檢測。Path VysisTM p53 DNA Probe Ki t購自美國Vys i s公司，由定位于17p13.1、17p11.1染色體的p53基因和CEP17著絲粒探針組成。單克隆抗體MDM2（鼠抗人, 稀釋倍數為1：60，）和p53（鼠抗人DO7，稀釋倍數為1:100，）均購自DAKO公司，山羊血清、生物素標記的抗小鼠I g G、抗辣根過氧化物酶標記的鏈酶素—卵白素復合物及DAB顯色液購自Santa Cruz公司。RNA提取試劑盒、引物、RNA酶抑制劑等試劑購自上海生工生物工程公司。MDM2序列為[3]：5′TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA3′,5′TGAAGGTTTCTCTTCCTGAAG3′（336bp）;β-actin序列為：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′，5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′（240bp）。

1.2 方法 1.2.1 間期細胞核FISH檢測：切片蛋白酶K消化處理、變性、37℃濕盒內雜交，0.3%NP-40/2×SSC和0.1%NP-40/2×SSC溶液73℃和常溫下洗脫， DAPI II復染后在Olympus BX60多色熒光顯微鏡觀察并計數熒光信號[4]。每例樣本連續觀察1 00個腫瘤細胞間期細胞核，計算單個細胞內紅色與綠色熒光信號數和比例，當30%以上的細胞群出現某種信號異常，則判定這種異常存在。紅色熒光信號數（p53）與綠色熒光信號數（CEP 1 7）的比值作為p 5 3缺失指數（deletion index，DI）。DI值＜1者規定為基因缺失。 1.2.2 免疫組織化學染色：切片常規脫蠟水化，3mL·L-1 H2O2封閉內源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液(1mL·L-1，PH6.0)微波修復抗原，非免疫山羊血清封閉 (10 Ml·L-1)，Ⅰ抗室溫孵育1h，滴加Ⅱ抗、 ABC復合液分別孵育30mi n，DAB-H2O2顯色，蘇木素復染、封片。PBS(0.01mo l·L-1)替代I抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。MDM2和p 5 3陽性表達者均為腫瘤細胞核著色（深棕色或棕黃色），細胞質和胞膜不著色(有時MDM2染色可見個別細胞質或/和胞膜呈淺黃色著色)。隨機計數1000個腫瘤細胞，陽性細胞所占該病變百分比區分：腫瘤細胞陽性數≤5%為陰性，＞6%為陽性。1.2.3 RT-PCR半定量分析：按照試劑盒說明抽提組織總RNA，反轉錄合成c DNA, 檢測c DNA濃度與純度, PCR反應條件為94℃預變性（2min）、93℃(40sec)、55℃ (35sec)、72℃(30sec)，經35個循環72℃延伸10mi n后瓊脂糖凝膠電泳（2%），對PCR電泳條帶進行定量分析。β-actin作為內參照。參考Bueso Ramos 標準，MDM2指數＝MDM2:β-actin ，以正常大腸黏膜作為對照，當大腸癌MDM2指數是正常對照的2倍以上時，規定為MDM2基因擴增[5]。 1.2.4 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件分析，定性資料采用χ2檢驗，P＜0.05時有顯著性差異。

表1 肝轉移與大腸癌諸臨床病理參數關系

表2 大腸癌MDM2、p 5 3基因蛋白表達與臨床病理參數分析

表3 MDM2基因擴增、p 5 3基因缺失與大腸癌侵襲能力、細胞分化的關系

2 結 果

2.1 大腸癌肝轉移與諸臨床病理參數關系將大腸癌為分兩組（肝轉移組與非肝轉移組）分析與臨床病理參數的關系發現：年齡、性別、部位和腫瘤大小與肝轉移未見相關性，癌組織浸潤深度、淋巴管侵襲、靜脈侵襲、淋巴結轉移與肝轉移間呈現正相關（P＜0.05，表1)

2.2 MDM2和p 5 3蛋白表達與臨床病理因素關系 MDM2、p 53蛋白表達與性別、部位、癌腫最大直徑、腫瘤分化程度、癌細胞浸潤深度、淋巴管侵犯間未見相關性，MDM2、p 5 3蛋白表達在淋巴結轉移組明顯高于不伴淋巴結轉移的大腸癌組（圖1－2），差異有顯著性（χ2=6.533，P=0.011和χ2=5.678，P=0.017）；有靜脈侵犯組MDM2蛋白表達明顯高于無靜脈侵襲組( 60.7% vs 31.8% ), 兩者間差異有顯著的統計學意義（χ2= 38.178，P =0.000，表2）。

圖1 免疫組織化學染色 P53基因蛋白在大腸癌組織的表達, 陽性者為腫瘤細胞核呈深棕色著色（ABC法，×200） 圖2 免疫組織化學染色MDM2基因蛋白在大腸癌組織的表達, 陽性者為腫瘤細胞核呈深棕色著色（ABC法，×200） 圖 3 P53基因FISH檢測 本病例DI＜1 為P53基因缺失。圖中可見大腸癌細胞內有2個綠色熒光信號（17號染色體）和1個紅色熒光信號（×1000） 圖 4 大腸癌MDM2 RT-PCR半定量分析 M：Mar ker；1：陰性對照；2-4：MDM2 有基因擴增；5-7:未見MDM2基因擴增

2.3 MDM2基因擴增、 p53基因缺失與大腸癌侵襲能力/細胞分化的關系 隨機抽取32例大腸癌標本進行了RT-PCR和FISH檢測，大腸癌組織p53基因缺失率為53.1%，有靜脈侵襲組p53 DI值＜1者占66.7%（圖3），比無靜脈侵襲組基因缺失率明顯增高（4 7.8%）。檢測MDM2 基因擴增情況顯示： MDM2 基因擴增率為28.1%（表3，圖4），比較擴增率與癌細胞分化程度的關系，分化好的大腸癌比分化差者MDM2 基因擴增頻率明顯增加（16.7%和42.9%）；有靜脈侵犯、淋巴結轉移的大腸癌MDM2基因擴增率亦明顯高于無靜脈侵犯、無淋巴結轉移病例（表3）。因用于MDM2基因擴增與P53基因缺失檢測的樣本量偏少, 經Fisher’s精確檢驗后未發現有統計學意義，今后將擴大樣本量進一步研究。

研究發現， MDM2基因蛋白表達陽性有31例，其中p53亦表達陽性有23例（74.2%），p53基因無表達者有8例（25.4%）； 在MDM2基因無表達者41個病例中, 33.3%（24例）病例p53表達陽性，MDM2與p53基因均無表達者有17例（23.6%），有部分病例MDM2基因擴增而蛋白表達無表達，部分病例p 53蛋白表達陽性，但未檢測到p53基因缺失。

3 討 論

Vogelstein繼 “大腸癌多階段發生發展”學說發表后，2000年提出 “p53基因網絡”假說，p 5 3基因與上、下游功能相關基因組成了一個復雜的基因網絡，p 5 3基因是聯系著不同遺傳應急和細胞應答的中間環節。p 5 3基因通過空間構象的改變，失去對細胞、凋亡和DNA修復的調節作用，轉變成癌基因[6-8]。p 5 3基因突變后誘導MDM2基因轉錄表達P90蛋白，形成P90- p53復合物使野生型p53失活。MDM2主要通過抑制p53基因轉錄活性、介導p 53的降解，實現對p 53功能的調節作用。MDM 2癌基因具有較強的成瘤性，本身可使細胞轉化，MDM2是p 5 3的轉錄靶基因，在野生型p53基因的誘導下轉錄表達增強，使細胞內MDM2蛋白水平升高，轉而與p 53結合形成復合物，抑制p53的轉錄活性，MDM2- p53反饋調節環路在腫瘤發生發展中起著重要作用[8-9]。

在對軟組織肉瘤、頭頸鱗癌、食道鱗癌和乳腺癌等的研究中，發現有MDM2蛋白表達或擴增與腫瘤復發、轉移密切相關[10-11]。大腸癌雖然是消化道惡性腫瘤中手術治療效果較好的腫瘤，但影響預后的最大因素仍然是轉移。隨著對治療方案的不斷改進，預防肝轉移、淋巴結轉移成為亟待解決的問題。本實驗從mRNA、DNA和蛋白水平探討了MDM2基因、p 5 3基因異常與大腸癌的關系，了解MDM2-p53反饋調節環路對大腸癌作用機制。本研究發現：大腸癌各階段均可檢測到MDM2蛋白表達（43.0%）和基因擴增（28.1%），MDM2擴增率在分化差的癌組織中表現增強，提示MDM2可能與腫瘤細胞分化程度有關。MDM2蛋白表達率為43.0%，基因擴增頻率為27.1%，可見MDM 2蛋白過度表達主要不是由于基因擴增，推測與轉錄增加有關。有靜脈侵襲、肝轉移的大腸癌組織MDM2基因高表達，推測MDM2基因在血行轉移尤其是在肝轉移判斷中有重要價值(P＜0.05)，與Adachi等對脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤的研究結果相似[12-14]。提示可作為判斷大腸癌患者靜脈侵襲、肝轉移等預后的生物學指標。

應用FISH和免疫組化技術檢測，發現p53基因缺失率53.1%，蛋白表達率為65.2%，p53基因異常與細胞增惡、侵襲性、轉移能力有關，符合“結直腸腺瘤-癌”的順序發生機理， 說明p53基因缺失、突變與大腸癌發生發展密切相關，是大腸癌致癌機制中重要的基因改變。 MDM2蛋白與p53蛋白表達有一定相關性， MDM2蛋白與p53蛋白高表達常常同時出現，兩者均陽性表達病例為74.2%，提示MDM2和p53基因參與大腸癌發生發展過程，MDM2-P53反饋機制是大腸癌細胞生長調控中的一個重要因素，在腫瘤發生和惡化過程中起重要作用。僅有少數病例MDM2蛋白表達和/或基因擴增而p 53基因表達缺失，可能是MDM2基因本身所具的成瘤性，或有其它機制在大腸癌演進中起主導作用，尚需增加標本量進一步深入研究。

統計分析表明，MDM2和p 5 3蛋白共同表達、MDM2基因擴增和p 5 3蛋白表達兩者共同存在時，肝轉移、淋巴結轉移占多數，提示與預后不良有關，與國外文獻報道相符[15-16]。本研究發現MDM2和p53基因異常與患者性別、腫瘤大小、部位和癌細胞浸潤腸壁深度未見相關性（P＞0.05）。 綜上所述，MDM2基因異常是大腸癌發生發展中較為常見的分子變化，它可能是除 p53基因突變以外導致大腸癌野生型p 53功能喪失的又一重要原因。MDM2在肝轉移組、靜脈侵襲組表達明顯增多，可作為判斷靜脈侵襲性和肝內微小轉移的參考指標；MDM2基因、p 5 3基因表達與淋巴結轉移、肝轉移有明顯正相關，提示兩基因與腫瘤細胞的侵襲性、轉移能力密切相關，聯合檢測對大腸癌預后評估有重要意義。

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A clinicopathological study of the Relationship of MDM2 and P53 gene with biological behavior in colorectal carcinoma

CHENG Zhi-qiang1, WANG Xiao-mei1，SHAN Jun2，et al.Depar tment of Pathology1and Depar tment of Radiology2, Shenzhen People’s Hospital .Shenzhen, 518020, China.

ObjectiveTo investigate the relationship of MDM2 gene, P53 gene with clinicopathologic parameters in colorectal carcinoma.MethodsThe detection of MDM2 amplification, p53 deletion and their protein in 72 patients by RT-PCR, FISH and immunohistochemical technique.Resu l t s The ratio of MDM2 and P53 gene expression in the group of the colorectal carcinoma was 28.1% and 53.1%, but protein expression was 43.0% and 65.0%,respectively.Expression of MDM2 and p53 protein was higher in the groups of lymph node metastasis than nometastasis,their dif ference had significant in statistics (P =0.011); expression of MDM2 between the groups of venous invasion(60.7%) and noinvasion(31.8%) was also shown evident ly dif ference (P =0.016).Conclusions MDM2-P53 pathway is a part of the carcinogensis of the colorectal carcinoma.The relationships of the expression of MDM2 gene and p53 gene were significantly detected with the liver metastasis, with lymph node metastasis and with venous invasion in colorectal carcinoma.MDM2 gene amplification was demonstrated and associated the relationship with venous invasion and liver metastasis significantly.This study suggests that the expression of MDM2 and p53 gene seem to be greater value as a biomarker of liver metastasis, lymph node metastasis and venous invasion in colorectal carcinoma.

MDM2 gene; p53 gene; colorectal carcinoma; FISH; RT-PCR

R735.34

A

10.3969/j.issn.1009-3257.2010.04.001

王曉玫

2010-06-03