蘇木、蘇木+黃芪對荷瘤小鼠CD4+CD25+調節性T細胞及相關調控分子的干預作用*

于明薇，孫桂芝，祁 鑫，李道睿，張培彤，吳 潔

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

腫瘤的發生、發展與機體的免疫狀態密切相關。長期以來，國內外研究均表明在T細胞中存在抑制亞群，能顯著下調免疫應答，并在腫瘤位點產生免疫耐受。Sakaguchi等在1995年發現鼠源性的CD4+CD25+雙陽性T細胞亞群，無論在體內還是體外均表現出獨特的抑制功能，Lewis肺癌移植鼠脾臟CD4+CD25+細胞數量與正常小鼠相比明顯升高，有利于腫瘤耐受的形成，降低免疫系統對腫瘤的免疫應答，促進腫瘤的發生和發展。本文將探討活血及益氣活血兩種不同治法中藥代表蘇木、蘇木+黃芪對Lewis肺癌移植小鼠脾CD4+CD25+調節性T細胞表達及相關調控分子表達的干預作用。

1 材料與方法

1.1 藥物

黃芪、蘇木浸膏由中國中醫科學院廣安門醫院制劑中心提供，生產批號20071121。

1.2 動物

C57BL/6小鼠，雄性，6～8周齡，體重20g±2g，清潔級，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供(許可證號SCXK-11-00-0006)，中國中醫科學院廣安門醫院動物室喂養(許可證號SYXK(京)2005-0001)。Lewis肺癌荷瘤鼠由中國醫學科學院藥物研究所提供。

1.3 試劑

FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD25、CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit、LD、MS Columns(Miltenyi Biotic)，RevertiAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，SYBR Green I Master Mix(Applied Biosystems)，引物由北京賽百盛生物技術公司合成。

1.4 儀器

FACS Calibur Flow Cytometer System(BD)，SM800解剖顯微鏡(Nikon)，VarioMACS磁性細胞分選儀(Miltenyi)，ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI)，DU-640型紫外分光光度計(Beckman)等。

1.5 方法

1.5.1 動物模型復制 取傳代后12d Lewis肺癌荷瘤小鼠，剝離瘤組織，選取生長良好的腫瘤組織，制備Lewis肺癌細胞懸液，每只小鼠右腋皮下接種0.2ml(約含活細胞1×106)。

1.5.2 分組及給藥 小鼠接種后隨機分為3組，接種后24h始至處死止，每日灌胃給藥1次。荷瘤對照組給予生理鹽水灌胃0.2ml/d，蘇木組、蘇木+黃芪組分別給予蘇木(1.67g生藥/(kg·d))、蘇木+黃芪(蘇木1.67g生藥/(kg·d)+黃芪15g生藥/(kg·d))中藥浸膏灌胃。

1.5.3 觀察指標 蘇木、蘇木+黃芪對小鼠體重的影響動態觀察:于接種后6、10、15、20d處死每組荷瘤小鼠各6只，稱荷瘤小鼠體重，剝離腫瘤組織，電子天平稱取瘤重。小鼠體重=荷瘤小鼠體重－瘤重。

蘇木、蘇木+黃芪對小鼠瘤重和抑瘤率的影響動態觀察:于接種后6、10、15、20d處死每組小鼠各6只，剝離腫瘤組織，電子天平稱取瘤重。按下列公式計算抑瘤率:抑瘤率(%)=[1－實驗組平均瘤重(g)/對照組平均瘤重(g)]×100%。

蘇木、蘇木+黃芪對小鼠肺轉移抑制率的影響:于接種后20d處死每組小鼠各6只，取肺用生理鹽水沖洗，Bouin液固定，解剖顯微鏡下觀察肺轉移灶個數。肺轉移抑制率(%)=[1－實驗組平均肺轉移灶個數(個)/對照組平均肺轉移灶個數(個)]×100%。

蘇木、蘇木+黃芪對荷瘤小鼠脾CD4+CD25+細胞表達的影響觀察:于接種后15d取每組小鼠各6只，摘眼球放血，斷頸處死小鼠，酒精消毒皮膚，迅速取脾稱重、研磨，200目濾網濾過包膜及脂肪組織等，加入2mL PBS，收集脾細胞懸液，計數細胞，取約1×106細胞重懸于100μL PBS中，按照試劑說明書進行FITC-CD4、APC-CD25染色，上機檢測。

小鼠脾CD4+CD25+細胞磁珠分離及純度檢測:接種后15d取每組小鼠各3只，無菌取脾，制備脾細胞懸液，溶血后按照CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit試劑說明書要求進行細胞磁性標記并分離，取1×106分選后細胞，流式細胞儀檢測分選純度。

蘇木、蘇木+黃芪作用后荷瘤小鼠瘤組織及脾分選后 CD4+CD25+細胞 Foxp3、CTLA-4 mRNA表達檢測:實時定量 RT-PCR檢測 Foxp3、CTLA-4 mRNA表達，取5×105分選后CD4+CD25+細胞和100mg瘤組織，分別提取 RNA。引物:Foxp3-S 5’-TGTGAGGACTAC-CGAGCC-3′， Foxp3-A 5′-AGGAGAAAGCGGATACCA-3′; CTLA4-S 5′-ACCTTCAGTGGT-GTTGGCTAG-3′， CTLA4-A 5′-TAAATCTGCGTCCCGTTGC-3′。PCR 反 應 條 件:95.0(C 5min，95.0(C 25sec，55.0(C 25sec，72.0(C 50sec，72.0(C 5min，循環次數為 40。設 β-actin 作為內參照。

1.5.4 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 蘇木、蘇木+黃芪對小鼠體重的影響動態觀察

各組小鼠體重隨荷瘤天數的增加呈下降趨勢，各時間點各組比較無統計學差異。

2.2 蘇木、蘇木+黃芪對小鼠瘤重和抑瘤率的影響動態觀察

表1顯示，6d瘤重蘇木組(0.10g±0.06g)與荷瘤對照組(0.24g±0.11g)相比存在差異(P<0.05)，10d瘤重蘇木+黃芪組(0.82g±0.13g)與荷瘤對照組(1.82g±0.28g)相比存在差異(P<0.05)，各組抑瘤率隨荷瘤天數的增加總體呈降低趨勢。

表1 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

表1 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

時間(d)蘇木組(%)蘇木+黃芪組(%)58.33 50.00 10 43.96 54.95 15 34.16 37.08 6 20 16.11 26.09

2.3 蘇木、蘇木+黃芪對荷瘤小鼠肺轉移抑制率的影響

表2顯示，各中藥組小鼠20d肺轉移灶個數均低于對照組，其中蘇木+黃芪組肺轉移抑制率為77.75%。

表2 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

表2 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

注:與荷瘤對照組比較:*P<0.05

荷瘤對照組 蘇木組 蘇木+黃芪組肺 轉 移 灶 個 數 12±7 9±3.6 2.67±1.53*肺轉移抑制率(%)—25.00 77.75

2.4 蘇木、蘇木+黃芪對荷瘤小鼠脾CD4+CD25+表達的影響

15d各組小鼠脾CD4+細胞表達無差異，蘇木+黃芪組小鼠脾 CD4+CD25+細胞表達(10.02±0.71)%低于荷瘤對照組(11.74±1.76)%(P<0.05)。

2.5 荷瘤小鼠脾CD4+CD25+細胞磁珠分離和純度檢測

經流式細胞儀檢測鑒定，分選后小鼠脾CD4+CD25+細胞純度為85.38% ～88.19%。

2.6 蘇木、蘇木+黃芪對荷瘤小鼠瘤組織及脾分選后 CD4+CD25+細胞 Foxp3，CTLA-4 mRNA表達的影響

表3 蘇木、蘇木+黃芪對荷瘤小鼠瘤組織及脾CD4+CD25+分選后細胞Foxp3、CTLA-4 mRNA表達的影響(s)

表3 蘇木、蘇木+黃芪對荷瘤小鼠瘤組織及脾CD4+CD25+分選后細胞Foxp3、CTLA-4 mRNA表達的影響(s)

注:與荷瘤對照組比較:*P<0.05

瘤組織(n=6)分選后CD4+CD25+細胞(n=3)組 別Ct(Foxp3/β-actin)Ct(CTLA-4/β-actin)Ct(Foxp3/β-actin)Ct(CTLA-4/β-actin )荷瘤對照組1.45±0.13 1.60±0.08 1.89±0.16 1.12±0.03 1.27±0.09蘇 木 組 1.69±0.09 2.03±0.18 1.21±0.06 1.32±0.17蘇木+黃芪組 1.73±0.08*2.08±0.09*1.24±0.07*

表3顯示，蘇木 +黃芪組荷瘤小鼠瘤組織CTLA-4 mRNA、Foxp3 mRNA表達低于荷瘤對照組(P<0.05);蘇木+黃芪組荷瘤小鼠脾CD4+CD25+分選后細胞Foxp3 mRNA表達低于荷瘤對照組(P<0.05)，而CTLA-4 mRNA表達3組間無差異。

3 討論

CD4+CD25+Treg最早在動物實驗中被發現，后續研究發現，這類細胞來源于胸腺，在小鼠的外周血、脾臟和淋巴結中均可發現，且具有相似的功能。在小鼠的脾臟和淋巴組織的CD4+T細胞中，CD4+CD25+細胞約占5% ～10%。CD4+CD25+Treg發揮免疫抑制功能的詳細機制尚未完全明了，目前認為主要通過作用下列靶細胞發揮作用:抑制效應性CD4+CD25-T細胞的活化增殖和免疫輔佐功能;抑制CD8+T細胞的增殖，抑制 IFN-γ、IL-2產生和CD25表達來抑制CD8+T細胞的活化，或直接殺傷CD8+效應T細胞;抑制樹突狀細胞成熟或下調DC的CD80和CD86共刺激分子表達;抑制T細胞依賴的B細胞產生免疫球蛋白等。

研究發現，Treg的抑制作用既發生在淋巴組織，抑制效應細胞活化的最初啟動階段，又發生在腫瘤微環境等外周性部位，抑制效應性細胞發揮殺傷腫瘤細胞等作用的最終效應階段，Treg對抗腫瘤免疫反應的整個過程都起一定的作用。腫瘤微環境最早于1979年由Lord正式提出，是腫瘤在其發生發展過程中所處的內環境，由腫瘤細胞本身、間質細胞、微血管、組織液及少量浸潤細胞，如樹突狀細胞、巨噬細胞等共同組成。局部微環境的腫瘤抗原可顯著誘導特異Treg細胞生成，稱為腫瘤特異Treg細胞。

Foxp3是Fox家族轉錄因子中的一員，有著調控CD4+CD25+Treg的發育及功能的作用。Foxp3基因高表達于淋巴組織，尤其特異性地表達于CD4+T細胞群，在其他細胞亞型和組織中也有極少量的表達，如B細胞、CD8+T細胞、腦組織、心臟、腎和肺。隨著對Foxp3研究的深入，發現無論是胸腺還是外周起源的CD4+CD25+Treg細胞都能特異性地表達Foxp3，由此推測Foxp3可能是CD4+CD25+Treg細胞特異性的標志。

CTLA-4是B7/CD28家族成員，Treg結構性表達CTLA-4，CD4+CD25+Treg細胞活化后，CTLA-4的表達增加，并持續表達。CTLA-4與效應細胞上的CD80/CD86結合，將抑制信號逆向傳遞給效應細胞，從而抑制效應細胞功能。此外，CD4+CD25+Treg表面的CTLA-4與DC細胞表面的CD80/CD86結合，通過逆向轉導的信號導致DC細胞內的吲哚氨2，3-雙加氧酶(IDO)活化，IDO是色氨酸代謝所必需的酶，由于IDO的活化使得游離的色氨酸減少，從而導致了T的活化程度降低。

蘇木味甘、咸、性平，具有活血散結、舒筋通絡、鎮靜、祛痰、止痛等功效。20世紀70年代，日本學者開始蘇木藥理作用的研究，通過幾十年來國內外不斷探索與研究，發現蘇木具有抗腫瘤活性。黃芪味甘、性溫，歸脾、肺經，可補氣升陽、固表止汗、托瘡生肌、利水退腫，為補氣之要藥。近年來研究認為，黃芪與活血藥配伍后具有增強活血藥抗血小板聚集作用，降低實驗動物全血比黏度，降低白細胞黏附性和白細胞黏附分子的表達率等作用。本研究結果顯示，益氣活血組方蘇木+黃芪較其單純活血藥成分蘇木有較好的抑瘤、抗轉移、下調CD4+CD25+細胞及相關調控分子表達的作用，提示蘇木+黃芪可通過影響荷瘤小鼠調節性T細胞及相關調控分子表達改善體內存在的免疫耐受狀態，而其在淋巴組織和腫瘤微環境中都表現出作用，也為中藥的全身調節特點提供了佐證。