脂多糖誘導人支氣管上皮細胞β防御素-3表達的時效和量效性

李 嘉, 張 兵, 鐘禮立, 王曼知

2.湖南省人民醫院兒科。

近年來,由于細菌耐藥株的日益增多,從新的角度研發抗感染物質,成為全球醫藥界面臨的緊迫問題,抗菌肽的研究為這一問題的解決帶來了希望。人 β防御素-3(human β-defensin-3,hBD-3)是最為引人注目的抗菌肽。它不僅具有廣譜抗微生物活性,而且能通過 Toll樣受體(Toll-like receptors,T LR)的介導,連接先天和獲得性免疫應答,保護黏膜和上皮細胞免受感染[2],成為抗感染研究熱點之一。但由于外源性 hBD-3獲取難度大、費用昂貴[3],在體內的活性可能被體液抑制[4]等原因,難以應用于臨床,故探索適當的內源性hBD-3誘導途徑成為該領域研究的重點。因此,了解內源性hBD-3的表達與誘導物的濃度以及誘導時間長短的關系有積極意義。急性呼吸道感染是我國兒童的常見病,所以,本研究以人支氣管上皮細胞為對象,選擇多種革蘭陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)為誘導物,觀察不同濃度、不同時間LPS誘導人支氣管上皮細胞后hBD-3的表達變化,為人工誘導、調控內源性hBD-3的表達增強其在體內的抗菌活性,從而為治療呼吸道感染打下基礎。

材料與方法

一、材料

(一)細胞株 人支氣管上皮細胞(HBEC)(購自中南大學湘雅醫學院湘雅細胞中心)。

(二)主要試劑 新生牛血清(FCS)(杭州四季青公司),1640(美國 GIBCO公司),LPS(E.coli L2880)及瓊脂糖(Sigma公司),T rizol(invitrogen公司),RT試劑盒(Fermentas公司),TAG酶及dNTP(tiangen公司),二乙基焦碳酸酯(DEPC)(北京鼎國生物技術公司),hBD-3引物及陽性對照β-actin引物由上海英駿生物工程技術服務有限公司合成,兔抗人hBD-3抗體(absun公司),辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉公司)。

二、方法

(一)實驗分組 生長良好人支氣管上皮細胞隨機分為5組,分別為對照組和4個不同濃度LPS組。其中,對照組加入含10%FCS的1640培基5 mL,LPS組又分為4組,分別加入含 LPS濃度為0.01、0.1、1和10 mg/L的10%FCS的1640培基5 mL,各組均置于培養箱(37℃,5%CO2)中培養,然后在誘導4 h后行免疫細胞化學染色檢測hBD-3蛋白的表達;分別在誘導 1、2、4和8 h后行 RT-PCR檢測hBD-3 mRNA的表達。

(二)免疫細胞化學檢測hBD-3蛋白的表達取生長良好的支氣管上皮細胞,0.25%胰蛋白酶消化后,調細胞濃度為1×107個/mL,細胞懸液接種在預先放置清潔無菌干燥蓋玻片的6孔板中,放入37℃含5%CO2培養箱中培養,24 h后倒置顯微鏡下見細胞貼壁。對照組和LPS組(0.1 mg/L)分別誘導4 h后檢測蛋白表達。一抗為兔抗人hBD-3抗體(1∶100稀釋),二抗為辣根酶標記山羊抗兔IgG。對照組用PBS代替一抗。

(三)RT-PCR檢測 hBD-3mRNA的表達 取不同實驗組的支氣管上皮細胞,分別在LPS誘導1、2、4和8 h后采用Trizol法抽提RNA。依吸光度值,取等量總 RNA進行反轉錄,含1 μ L隨機引物,2 μ L dNTP,1 μ L 反轉 錄酶(MMLV), 總體積 20 μ L。反應條件為：70 ℃5 min,37 ℃5 min,42℃60 min,70℃10 min。以反轉錄產物為模板,采用Tag酶,按以下程序進行 PCR。上游引物為：5′-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3′,下 游 引 物為 ：5′-CTTCGGCAGCAT TT TCGGCCA-3′,產 物長206 bp。反應條件為：98℃預變性5 min,再經94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s共32個循環,最后72℃延伸7 min。產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。同時設陽性對照β-actin,產物長450 bp。

三、統計學處理

結 果

一、免疫細胞化學染色檢測hBD-3蛋白表達

對照組人支氣管上皮細胞中hBD-3蛋白有微量表達,胞質呈淡棕色顆粒。用0.1 mg/L的LPS誘導細胞4 h后,用hBD-3多克隆抗體染色,可見培養的支氣管上皮細胞胞質中hBD-3蛋白明顯表達,呈棕褐色陽性顆粒,結果見圖1。

二、RT-PCR檢測hBD-3 mRNA的表達

(一)對照組人支氣管上皮細胞hBD-3 mRNA的表達 發現對照組人支氣管上皮細胞中 hBD-3 mRNA有微量表達,不同時間組間(1、2、4和8 h)差異無統計學意義,結果見表1、圖2。

(二)LPS誘導人支氣管上皮細胞hBD-3mRNA表達的量效關系 用不同濃度的LPS(0.01、0.1、1、10 mg/L)誘導人支氣管上皮細胞后,在每個相同時間點(1、2、4和8 h)hBD-3mRNA表達均隨之增多,且在上述濃度范圍內呈劑量依賴型,不同濃度組間比較差異有統計學意義(P＜0.01),結果見表1、圖3。

圖1 hBD-3蛋白表達的免疫細胞化學染色結果FIG.1.The immunocytochemical stain showing hBD-3 expression

圖2 對照組HBEC hBD-3mRNA的表達FIG.2.The expression of hBD-3 mRNA in HBECs in control group

(三)LPS誘導人支氣管上皮細胞hBD-3mRNA表達的時效關系 每一相同濃度LPS(0.01、0.1、1和10 mg/L)在誘導人支氣管上皮細胞不同時間(1、2、4和8 h)后,隨時間增加hBD-3 mRNA表達量亦增加,在同一濃度組呈時間相關性,不同時間組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)。hBD-3 mRNA表達的半定量結果以hBD-3/β-actin吸光度的相對值計算,結果見表1、圖4。

(四)LPS濃度與hBD-3 mRNA表達的相關性從圖5可見,每個相同時間點LPS濃度與hBD-3mRNA 表達呈正相關(1、2、4和8 h的r=0.98,P＜0.01)。同一濃度下,LPS誘導人支氣管上皮細胞8 h后所產生的hBD-3 mRNA明顯高于1 h組,并且這種差距隨誘導濃度增加而增大。

圖3 LPS誘導HBEC不同時間后hBD-3mRNA的表達FIG.3.The expression of hBD-3 mRNA in HBECs induced by LPS for different times

表1 不同濃度 LPS不同時間點hBD-3mRNA的表達(±s)(n=8)Table 1.The mRNA expression of hBD-3 at different time points after stimulation by different concentrations of LPS(±s)(n=8)

表1 不同濃度 LPS不同時間點hBD-3mRNA的表達(±s)(n=8)Table 1.The mRNA expression of hBD-3 at different time points after stimulation by different concentrations of LPS(±s)(n=8)

*P＜0.01 versus control;▼P＜0.01 versus the previous lower concentration;▲P＜0.01 versus the previous time point.

0(control) 0.10±0.005 0.11±0.003 0.09±0.004 0.11±0.007 0.01 0.13±0.002* 0.16±0.007*▲ 0.20±0.003*▲ 0.24±0.006*▲0.1 0.18±0.009*▼ 0.22±0.003*▼▲ 0.26±0.002*▼▲ 0.31±0.003*▼▲1 0.22±0.003*▼ 0.27±0.008*▼▲ 0.34±0.011*▼▲ 0.43±0.004*▼▲10 0.27±0.011*▼ 0.35±0.010*▼▲ 0.42±0.009*▼▲ 0.51±0.010*▼▲

圖4 不同濃度LPS誘導HBEC不同時間后hBD-3mRNA的表達FIG.4.The expression of hBD-3 mRNA in HBECs induced by different concentrations of LPS for different times

圖5 LPS濃度與hBD-3 mRNA表達的相關關系FIG.5.Relationship between LPS concentration and the expression level of hBD-3 mRNA

討 論

宿主的防御功能和病原體毒力的相互作用是感染發生、發展和轉歸的關鍵。細菌除具有毒力外,還需要足夠的數量才能引起感染。細菌數量越多,釋放的毒素越多,產生的毒力越強,炎癥反應越重。本研究選擇不同濃度LPS誘導人支氣管上皮細胞,是為了研究不同數量的細菌毒素在人體下呼吸道產生的炎癥反應所導致hBD-3表達強弱的變化,從而探討如何采用可調控方式誘導其分泌;選擇不同誘導時間是為了了解hBD-3表達在誘導后何時起效,持續的時間多長。

本研究利用多種革蘭陰性菌死亡后釋放的產物LPS誘導人支氣管上皮細胞,觀察hBD-3能否被誘導表達。通過免疫細胞化學染色我們發現,人支氣管上皮細胞胞質中有淡棕色顆粒,有微量hBD-3蛋白表達;用一定濃度的LPS誘導4 h后,可見培養的支氣管上皮細胞胞質中有棕褐色陽性顆粒,hBD-3蛋白表達明顯,證實hBD-3在人支氣管上皮細胞有表達并能被誘導。

本研究采用半定量RT-PCR發現,LPS在一定濃度范圍(0.01～10 mg/L)內誘導hBD-3mRNA的表達呈劑量依賴性;每一相同時間點LPS濃度與hBD-3 mRNA表達呈正相關;同一濃度下,LPS誘導人支氣管上皮細胞8 h后所產生的hBD-3 mRNA明顯高于1 h組,并且這種差距隨誘導濃度增加而增大。推測隨著細菌數量增多,毒素增多,感染加重,hBD-3分泌亦增加,機體抵抗細菌感染的能力也增加,可能在局部免疫防御反應中起著重要作用。本研究誘導物的劑量范圍為0.01～10 mg/L,是參考了廖偉等[5]的報道,當劑量＜0.01 mg/L時,機體是否會被誘導表達,＞10 mg/L時,是否會引起過激反應而對機體有害,目前尚不清楚,有待我們進一步研究。

本研究中,我們利用LPS誘導人支氣管上皮細胞后,用RT-PCR檢測不同時間細胞中hBD-3的表達水平。發現hBD-3 mRNA在誘導后1 h即有較強表達,并隨著時間增加表達亦隨之上調,在一定時間范圍(1～8 h)內呈時間相關性,表明hBD-3 mRNA的誘導表達具有明顯的時效關系。推測當細菌侵襲下呼吸道時,hBD-3在短時間內即可誘導表達,是一個即早應答事件,參與氣道最初的防御反應。在沒有LPS誘導下,人支氣管上皮細胞在不同時間點所產生的hBD-3 mRNA差異無統計學意義,推測正常人體內支氣管上皮細胞hBD-3呈恒定表達,細菌感染在誘導hBD-3表達中占據重要地位,一旦機體受到外界病原體入侵時,即可能通過自身防御機制增強hBD-3表達,起到抗感染作用。

鐘小林等[6]在用 LPS誘導小鼠心、肝、脾、肺、腎各組織后,僅在肝臟組織中檢測到hBD-3 mRNA的表達,并在注射后6 h才出現,8、10 h達峰值,12 h后表達水平下降。本研究與之相比,誘導表達時間出現較早,考慮與hBD-3在呼吸道上皮細胞中表達相對較多以及不同物種和細胞中信號傳導途徑可能不一樣有關。本研究未看到hBD-3表達的衰減,可能因觀察時間尚不夠長所致。在下一步的研究中,可進一步觀察隨時間增加hBD-3表達的變化及有無衰減的過程,為研究hBD-3治療的時間窗及藥動學打下基礎。

hBD-3乃至抗菌肽功能的深入研究需得到有活性的肽,在抗菌過程中真正起作用的也是蛋白。急性時相反應蛋白在疾病的早期輔助診斷和監測以及對機體的保護作用中至關重要。相對于鐘小林等[6]僅從基因水平上研究hBD-3的表達不同,本課題的前期研究中還從蛋白水平研究了hBD-3表達的變化,同樣發現正常人支氣管上皮細胞中hBD-3蛋白有微量表達[7],用不同濃度LPS誘導培養的上皮細胞,4 h后即出現hBD-3蛋白的明顯表達,并在一定范圍內呈劑量依賴性。進一步說明了 hBD-3與LPS的劑量依賴關系,為以后hBD-3作為抗菌物質的使用打下基礎。

[1] Koczulla A R,Bals R.Antimicrobial peptides：current status and therapeutic potential[J].Drugs,2003,63(4)：389-406.

[2] Harder J,Bartels J,Christophers E,et al.Isolation and characterization of human beta-defensin-3,a novel human inducible peptide antibiotic[J].J Biol Chem,2001,276(8)：5707-5713.

[3] 庹曉曄,徐明達,陳璧,等.人β防御素3在大腸桿菌中的融合表達及其抗微生物活性的初步分析[J].軍事醫學科學院院刊,2004,28(2)：114-122.

[4] Maisetta G,Di Luca M,Esin S,et al.Evaluation of the inhibitory effects of human serum components on bactericidal activity of human beta-defensin-3[J].Peptides,2008,29(1)：1-6.

[5] 廖偉,錢桂生,雷撼.脂多糖及前炎癥細胞因子誘導人原代氣道上皮細胞β防御素-2表達的實驗研究[J].中國呼吸與危重監護雜志,2007,6(2)：127-130.

[6] 鐘小林,楊衛華,周建新,等.小鼠β防御素-3基因表達調控的初步研究[J].重慶醫學,2004,33(6)：841-844.

[7] 李嘉,張兵,鐘禮立.不同濃度脂多糖誘導人支氣管上皮細胞β防御素3的表達[J].中國當代兒科雜志,2009,11(7)：577-580.