草莓內生細菌的分離及草莓灰霉病菌拮抗菌的篩選鑒定

李 娜， 戴美學

（山東師范大學生命科學學院，濟南 250014）

植物內生細菌在植物體內有穩定的生存空間，一旦進入植物體內，即可獨立繁殖和傳遞，并占據有利的生態位點來防止病原菌的入侵［1］。因此有益的內生細菌有可能成為生物防治中很有發展潛力的生防因子。

草莓灰霉病是導致草莓產量和質量降低的主要限制因素之一［2］。目前，對草莓灰霉病的防治以化學手段為主，但研究表明隨著灰霉抗性菌株的增加，化學防治的優勢正在下降［3－4］，且存在農藥殘留問題［5］。因此安全、低毒的生物防治已成為研究的熱點，作為生物制劑的木霉和酵母菌已在灰霉病的防治中發揮重大作用［6－7］。研究證明生物制劑如能阻止或減少灰霉菌對于草莓花朵的侵染，就能有效地控制灰霉病害［8］，而內生細菌能發揮該項作用。

草莓內生細菌具有通過產生吲哚乙酸和溶解有機磷來促進植株生長的作用［9］，但對其生防作用的研究國內外尚未有報道。本文對防治草莓灰霉病菌的內生細菌進行篩選，并對一株高效菌株SL6進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

董家草莓基地3個大棚中生長旺盛的草莓，在不同層次，不同區域以五點取樣法取草莓根、莖、葉。

1.1.2 培養基

PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000mL，pH 自然；NA：牛肉膏3.5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g、水1 000mL，pH7.0～7.2。

1.1.3 靶標病原菌

草莓灰霉病菌（BotrytiscinereaPers.ex Fr.），本試驗室保存菌種。

1.1.4 引物

16SR1（AGAAAGGAGGTGATCCAGCC）；16SF1（AGAGTTTGATCC TGGCTCAG）由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 草莓內生菌的分離

1.2.1.1 表面消毒時間的選擇

為了既能保證植物組織的青翠，以獲得較多的內生菌，又能保證表面消毒徹底，需要通過一系列試驗尋找恰當的HgCl2消毒時間。將草莓根、莖、葉用0.1%HgCl2處 理1、1.5、2、2.5、3、3.5、4min。然后將處理后的根、莖、葉在NA培養基，28℃培養箱中培養3～5d，觀察是否有菌的生長。

1.2.1.2 表面消毒

將植物組織用清水沖洗干凈，無菌水沖洗10次，在75%乙醇中消毒5min，無菌水沖洗3次，最佳0.1%HgCl2時間消毒后，無菌水沖洗3次。

1.2.1.3 內生細菌的分離

將檢出的消毒徹底的組織采用五點取樣法剪成0.5cm×0.5cm左右的小塊，組織勻漿器研磨充分，依次稀釋，取原液、10－1、10－2、10－3稀釋度的組織液0.1mL涂布于NA平板，每種樣品3個重復，37℃培養箱中倒置培養2～5d。

1.2.1.4 內生細菌的純化

培養3～5d后，挑取不同形態的菌落于NA平板上畫線純化。

1.2.2 拮抗細菌的篩選與拮抗性能測定

1.2.2.1 草莓灰霉菌拮抗菌的篩選

采用對峙培養法，取直徑8mm的靶標菌菌餅置于PDA平板（d＝90mm）中央，用接種環挑取純化好的菌種點接在距平板中央3cm處的4個角點上，25℃培養7d后測量抑菌帶寬。每處理設3個重復。選出對病原菌生長有抑制作用，且被抑病原菌絲邊緣平齊、拮抗作用持久的菌株。

1.2.2.2 拮抗菌株的拮抗性能測定

進入復篩的菌株，按上述方法做對峙試驗，以接種靶標菌餅的平板做對照，每處理設3個重復，25℃培養3～5d，直到對照平板布滿灰霉菌，測量抑菌圈半徑（細菌菌落中心至病原菌菌絲邊緣）。

1.2.2.3 SL6發酵濾液的抑菌作用測定

抑菌效果最佳的SL6菌株在37℃振蕩培養3d后，發酵液離心（12 000r／min，20min），取上清液用細菌過濾器（0.25μm）除菌，得無菌發酵液，取1mL發酵濾液加入到熔化的25mL PDA培養基中，混勻后制平板，以不加發酵濾液的PDA培養基為對照。同步接種草莓灰霉病菌菌絲塊，每個處理重復3次，于25℃培養箱中培養，待對照板菌絲觸及平板邊緣開始測量，計算加入濾液的平板菌絲生長直徑的平均值，利用公式可得出其抑菌率。對無菌發酵濾液進行梯度稀釋后，同樣方式，測其稀釋后的抑菌率。挑取經過濾液處理及對照平板上的邊緣菌絲，在掃描電鏡下觀察菌絲形態。

抑菌率＝（對照板菌絲直徑一處理板菌絲直徑）／（對照板菌絲直徑一霉菌菌塊初始直徑）×100%。

1.2.3 拮抗細菌的初步鑒定

根據拮抗細菌菌株的形態、培養性狀和生理生化特性的測定結果，參考《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行鑒定［10－11］。

1.2.4 拮抗細菌的分子鑒定

抽提拮抗菌總DNA，利用16SrDNA細菌通用引物R1和F1進行PCR擴增。擴增產物回收，送至上海生工生物科技公司測序。測序結果用Blast軟件在GenBank中進行同源性比較。

1.2.5 菌株系統發育分析和系統發育樹構建

從GenBank中查找已經測序的同屬菌的16S rDNA序列用ClustalX進行多序列比對分析，再用MEGA4軟件中Neighbor－Joining法構建系統發育樹，并進行1 000次Bootstraps檢驗。

2 結果

2.1 選擇HgCl2消毒時間

由表1可以看出，草莓根、莖、葉所需的0.1%HgCl2最佳消毒時間不同，根部所需處理時間最長，需3.5min。葉所需時間為3min，莖部需要2.5min，這可能與植物各個器官的生理結構相關。

2.2 各組織中內生細菌的數量

由表2可知，草莓的各個組織結構中均有內生細菌定殖，但不同組織中內生細菌分布的密度不同，草莓莖部內生細菌的含量為2.29×104～3.95×104cfu／g鮮重，葉中為3.22×103～9.66×103cfu／g鮮重，草莓根部的內生細菌的含量最少，為2.8×101～5.3×101cfu／g。根據菌落形態、顏色及分離部位的不同，共純化得內生細菌54株。且不同組織結構中內生菌的種類也不相同，莖中分得形態顏色不同的菌株27株，葉中15株，根中12株。可見，內生細菌的分布密度及種類均與所在植物的部位相關。

表2 草莓不同組織中內生細菌的含量

2.3 拮抗內生細菌的抑菌效果及形態學和生理生化特性的鑒定

2.3.1 拮抗內生細菌的拮抗能力測定

平板對峙試驗測定結果表明，5株內生細菌具有較為明顯的拮抗作用，抑菌半徑最低為7mm，最高的SL6可達15mm（表3、圖1）。

表3 5株內生拮抗菌株的抑菌能力1）

2.3.2 SL6發酵濾液的拮抗作用

通過對于生長直徑的測量，運用公式得出，SL6的發酵濾液對草莓灰霉病菌菌絲的抑制率達97.6%（圖2）。稀釋100倍后，抑菌率為53.7%，有較好的抑菌效果（圖3）。掃描電鏡下對混有發酵液及空白對照平板上菌絲的形態觀察顯示，對照菌絲光滑、修長，濾液處理組菌絲部分膨大變形甚至斷裂，原生質體溢出（圖4）。與平板對峙試驗中，對菌絲的作用一致。推測是活性物質的溶菌作用所致。具體的活性物質成分還有待于進一步的研究。

圖1 SL6抑菌效果

圖2 SL6無菌發酵液的拮抗活性檢測

圖3 SL6無菌發酵液稀釋后的抑菌效果

2.3.2 拮抗內生菌的形態學和生理生化測定結果

通過形態學觀察和生理生化特征的測定，對草莓灰霉病菌有抗菌作用的5株內生細菌進行了初步鑒定，結果見表4、5。

表4 5株內生拮抗菌形態及染色特征

表5 5株內生拮抗菌生理生化測定結果1）

圖4 SL6無菌發酵液對菌絲的抑制作用

5株菌株幼齡培養物均成桿狀，革蘭氏陽性，芽胞為卵圓球形，以周生鞭毛運動，好氧或兼性厭氧，革蘭氏陽性，接觸酶反應呈陽性，不產生吲哚，確定其均歸屬于芽胞桿菌屬（Bacillussp.）［10－11］。

2.3.3 菌株SL6系統發育分析

菌株SL6的16SrDNA PCR產物長度為1 487bp，此序列在GenBank數據庫中的注冊序列號為FJ948786.1。由構建出的系統發育樹可知，SL6與芽胞桿菌屬的菌株同源性高，與枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）DCC1106（EU276080）在同一分支上，結合生理生化鑒定結果，可鑒定菌株SL6為枯草芽胞桿菌。系統發育樹見圖5。

3 討論

內生細菌定殖在植物的內部［12］，通常能夠促進植物的生長，且不會對植物的組織器官造成傷害［13］，是植物組織內的正常菌群，可以通過組織學方法或從表面嚴格消毒的植物組織和汁液中分離獲得［14］。本研究表明，草莓根、莖、葉組織中均存在大量內生細菌，各組織內生細菌的密度不同，范圍在2.8×101～3.95×104cfu／g鮮重之間。

圖5 菌株SL6的系統發育樹

本研究通過設計不同的梯度來確定升汞的最佳消毒時間，以達到使分離的內生細菌盡可能真實地反映植物內的微生物群落的效果。過長的消毒時間導致內生細菌種群密度減少；消毒時間較短，附生細菌會干擾內生細菌密度的計算；且不同組織器官，因其構造的不同，需要的消毒時間也會有差異。

內生菌種有很多抗性菌株，具有提取各種抗菌物質的潛力［15－16］，是生物防治中起重要作用的生防因子。目前，從植物內部分離得到的生防細菌已有多種，如：王書同從番茄植株中分離得到一株內生枯草芽胞桿菌對番茄灰霉病菌的抑制率達71.1%［17］，但對草莓內生細菌生防作用的研究，目前國內外尚未報道，本研究從草莓中篩選得到內生枯草芽胞桿菌SL6，其無菌發酵液對草莓灰霉病菌的抑制率可達97.6%，具有生防菌的潛能。對其發酵濾液進行分析可知是抗菌蛋白在起作用，但分離純化的方法有待進一步研究，以期得到在病害生物防治中能起作用的抗菌蛋白。

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