甘肅省南瓜及西葫蘆小西葫蘆黃花葉病毒病鑒定

文朝慧， 劉雅莉

（甘肅出入境檢驗檢疫局，蘭州 730020）

小西葫蘆黃花葉病毒［Zucchiniyellowmosaic virus（ZYMV）］屬馬鈴薯Y病毒屬成員，病毒粒子為彎曲線狀，長750nm，直徑11nm，含一條單鏈正義RNA。該病毒1973年首次分離于意大利［1］，主要通過蚜蟲以非持久性方式高效傳播［2］，能侵染葫蘆科、豆科、莧科、藜科等11科植物［3］，目前在澳大利亞、法國、德國、西班牙、英國、美國、日本等廣泛發(fā)生，是世界性分布和危害最嚴(yán)重的病毒之一。被小西葫蘆黃花葉病毒侵染的葫蘆科作物，葉片黃化并帶有嚴(yán)重花葉、畸形，產(chǎn)量大幅度降低［4］。據(jù)Tóbiás［5］、Schrijnwerkers［6］等研究，ZYMV 可通過南瓜和筍瓜的種子進(jìn)行傳播。

甘肅省河西地區(qū)氣候干燥，光照充足，晝夜溫差大，綠洲與戈壁交錯形成天然的隔離條件，病蟲危害輕，是各類農(nóng)作物制種的理想基地，目前該地區(qū)已發(fā)展為我國重要的對境外制種基地，其對外繁種的瓜類作物有西瓜、甜瓜、黃瓜、冬瓜、苦瓜、西葫蘆、南瓜、瓠瓜、角瓜等多種。這些作物原種來自國外，繁育收獲后的種子出口到美國、德國、荷蘭、以色列、日本、韓國、我國臺灣等30個國家或地區(qū)，因而每年出入境的南瓜、西葫蘆等作物種子眾多。近年來，河西地區(qū)瓜類作物病毒病害發(fā)生嚴(yán)重，田間發(fā)病率可達(dá)15%，但病原不清，為明確ZYMV在當(dāng)?shù)毓项愖魑锷系奈：η闆r，作者對該地區(qū)南瓜［Cucurbitamoschata（Duch.）Poiret］和西葫蘆（C.pepoLinn.）的田間病樣和出入境種子含帶小西葫蘆黃花葉病毒情況進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查和鑒定，利用植物病毒的抗血清對全部樣本進(jìn)行了ELISA檢測，對ELISA部分陽性樣本進(jìn)行了RT－PCR擴(kuò)增、測序及序列分析。

1 材料和方法

1.1 病害調(diào)查和樣本采集

1）2006－2008年每年7月，在甘肅省河西地區(qū)采集可能被病毒感染、癥狀明顯的南瓜、西葫蘆葉片及果實，分別裝在不同的潔凈塑料袋中，標(biāo)明采集時間、地點和材料，保存于－70℃低溫冰箱。

2）供試種子58份，為本實驗室檢測的河西地區(qū)出入境種子，檢測樣本為隨機(jī)抽取材料。

1.2 主要試劑

ZYMV酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自美國Agdia公司；Trizol購自Invitrogen公司；M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、TaqDNA 聚合酶、dNTP、100bp ladder DNA marker購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 DAS－ELISA檢測

采用堿性磷酸酯酶標(biāo)記雙抗體夾心法（DASELISA）對全部樣本進(jìn)行血清學(xué)檢測，具體檢測步驟參照提供抗體的公司產(chǎn)品說明書。以健康植株／種子為陰性對照，樣品A值／陰性對照A值大于2為陽性反應(yīng)，A值利用 MUTISKAN型Thermo labsystems酶標(biāo)儀在405nm波長下測定。

1.4 RT－PCR擴(kuò)增和測序分析

1.4.1 引物合成

根據(jù)GenBank已報道的ZYMV病毒基因組保守序列，設(shè)計并合成寡核苷酸引物。p1：5′－ATGCAGAGGCACCATACAT－3′；p2：5′－TACTGCATTGTGTTCACACC－3′［7］。預(yù) 期 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 大 小 為283bp。

1.4.2 植物組織總RNA的提取

1）田間病樣以Trizol法提取。稱取0.1g植物葉片倒在潔凈的研缽內(nèi)，加液氮研細(xì)，移入1.5mL離心管中（DEPC處理），加入1mL的Trizol，劇烈振蕩3min以上；4℃下，12 000r／min離心10min以除去不溶成分，將上清轉(zhuǎn)入另一新的1.5mL離心管中；加0.2mL氯仿，振蕩混勻15min，然后在室溫下靜置2～15min，再于4℃、12 000r／min離心15min；將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇，上下顛倒混勻；室溫靜置15min；4℃、12 000r／min離心10min，棄上清，加入75%乙醇洗滌沉淀，然后4℃、7 500r／min離心5min，棄乙醇；室溫晾干5～10min，加入30μL DEPC處理的超純水溶解，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）種子樣本以SDS－酚氯仿法提取［8］。稱取2.5g種子放入預(yù)冷的研缽內(nèi)，加液氮研磨成粉末狀，將粉末轉(zhuǎn)入15mL預(yù)冷的離心管中，加入6mL RNA抽提緩沖液（50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0；10mmol／L EDTA，pH 8.0；140mmol／L NaCl；1%SDS；2%PVP）及等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），振蕩均勻，冰浴10min；4℃、12 000r／min離心15min；取上清液，加等體積氯仿：異戊醇（24∶1）、1／4體積無水乙醇、1／10體積5mol／L乙酸鉀，振蕩均勻，冰浴10min；4℃、12 000r／min離心15min；將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，以異丙醇沉淀RNA，其余步驟同1）。

1.4.3 RT－PCR反應(yīng)

cDNA第1鏈的合成：以1μL總RNA為模板，加入1μL dNTP（10mmol／L）、10μL DEPC 水、2μL p2，70℃保溫5min后，冰上放置2min，再加入4μL 5×反轉(zhuǎn)錄buffer、1μL RNAsin（40U／μL）、1μL M－MLV（200U／μL），37℃反應(yīng)40min。

PCR：以合成的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后在72℃延伸10min。取10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，凝膠成像儀分析并記錄結(jié)果。

1.4.4 序列測定和序列相似性比較

RT－PCR產(chǎn)物用UNIQ－10柱式PCR純化試劑盒（Sangon）純化后，直接用于測序，序列測定在ABI 3730XL DNA測序儀上完成（委托TaKaRa公司進(jìn)行）。測序結(jié)果通過BLASTn與GenBank中目標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行相似性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜和西葫蘆ZYMV病毒病的癥狀

在田間病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，瓜類作物受病毒病侵染后，常常表現(xiàn)為系統(tǒng)花葉，病葉出現(xiàn)斑駁、皰斑、皺縮（封面a），病果實表面斑駁、有瘤狀突起、果形扭曲等（封面b），僅根據(jù)田間癥狀難以確定所感染的病毒種類。

結(jié)合實驗室檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受ZYMV侵害后，發(fā)病初期西葫蘆葉片出現(xiàn)局部褪綠斑、明脈，后表現(xiàn)葉片花葉，新葉上有皰斑甚至發(fā)生嚴(yán)重的蕨葉現(xiàn)象（封面c），而南瓜病葉的癥狀與西葫蘆的相似。

2.2 DAS－ELISA檢測結(jié)果

在南瓜和西葫蘆田間病樣中均檢測出ZYMV，其中10個南瓜顯癥葉片樣本中有5個感染ZYMV，9個西葫蘆顯癥葉片樣本中有3個感染ZYMV。在24份南瓜種子中有3份檢出ZYMV，分別為來自我國臺灣、荷蘭和以色列，種子帶毒批次占12.5%；在34份西葫蘆種子中有4份檢出ZYMV，其中3份占從美國、韓國、哥斯達(dá)黎加進(jìn)境的種子，1份為出境的種子，種子帶毒批次占11.8%。

2.3 RT－PCR擴(kuò)增及序列分析

RT－PCR擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖1），ZYMV陽性樣品擴(kuò)增出約280bp的條帶，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，且無非特異性片段的產(chǎn)生；陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。

經(jīng)序列測定和序列相似性比較，該擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列與世界各地的ZYMV分離物CP基因相似性大于93%，證明該DNA片段為ZYMV的部分序列。

圖1 RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

小西葫蘆黃花葉病毒自1991年在國內(nèi)首次報道發(fā)生以來［9］，在河南、陜西、河北、山西、北京、廣州、浙江杭州和廣西等地的葫蘆科作物上相繼發(fā)現(xiàn)危害，已成為我國葫蘆科作物的主要病原［10］。目前ZYMV雖然不屬于檢疫對象，但其在多個國家和地區(qū)發(fā)生流行，危害嚴(yán)重，2006－2008年筆者已數(shù)次在出入境種子中檢測到該病毒，ZYMV在甘肅河西地區(qū)除侵染南瓜和西葫蘆外，也危害黃瓜、西瓜和甜瓜等其他瓜類作物（待發(fā)表）。在調(diào)查和檢測中發(fā)現(xiàn)，河西地區(qū)瓜類作物病毒病的病原還有黃瓜花葉病毒（CMV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV），從檢出頻率看ZYMV是侵染甘肅瓜類作物的重要病毒種類。

Heather對ZYMV的進(jìn)化研究表明，人為傳播在ZYMV的世界性傳播蔓延中起重要作用［11］。Fletcher的田間試驗表明，作物早期及中期感染ZYMV將造成產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失［12］。在作者的檢測中，西葫蘆種子帶毒批次占11.8%，南瓜種子帶毒批次占12.5%，證實ZYMV可隨南瓜和西葫蘆帶毒種子的調(diào)運而傳播蔓延，如果播種帶病種子，長出的幼苗發(fā)病后，就形成田間初侵染源，加之河西地區(qū)夏季高溫干旱，蚜蟲發(fā)生量大，很容易造成瓜類作物病毒病的發(fā)生流行，因此加強(qiáng)種子檢疫、種植無毒種子是防治該病毒病的重要措施。

ZYMV的常規(guī)檢測手段包括生物學(xué)檢測、電鏡觀察及免疫學(xué)方法等，分子檢測技術(shù)大多以感染ZYMV的植株葉片為檢測材料，筆者除檢測田間顯示癥狀的葉片外，還直接對西葫蘆和南瓜干種子進(jìn)行了檢測。鑒于種子帶毒的不均勻性，在用RTPCR方法檢測種子中的ZYMV時，對一份樣品需要設(shè)置多個重復(fù)，以提高診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究采用DAS－ELISA和RT－PCR相結(jié)合的方法，鑒定了引起甘肅河西地區(qū)南瓜及西葫蘆病毒病的小西葫蘆黃花葉病毒，分析了田間發(fā)生和種子帶毒情況，建立了切實有效的檢測體系與方法，為該病害的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

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