蟲酰肼對甜菜夜蛾六類酶活性的影響

王貽蓮, 司升云, 汪鐘信, 宮成玉, 周利琳

(1.武漢市蔬菜科學研究所,武漢 430065; 2.山東省科學院中日友好生物技術研究中心,濟南 250014;3.華中農業大學植物科學技術學院,武漢 430070; 4.煙臺出入境檢驗檢疫局,煙臺 264000)

蟲酰肼是一種昆蟲生長調節劑,能模擬蛻皮激素20-羥基蛻皮酮與目標害蟲蛻皮激素受體復合物相互作用,實現蛻皮激素的作用方式。到目前為止,國內外對酰肼類殺蟲劑引起甜菜夜蛾抗藥性的研究還較少,僅限于作用機理、抗性監測等方面,在抗性遺傳及抗性機制等方面報道較少[1-3]。為研究甜菜夜蛾對蟲酰肼的抗藥性機制,本文采用活體測定法對甜菜夜蛾武漢敏感(CK)種群和自然(N)種群進行了表皮酚氧化酶(PPO)、乙酰膽堿酯酶(TCE)、谷胱甘肽-S轉移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)酶活力測定,采用PAGE凝膠電泳對CK種群、汰選種群和N種群的酯酶同工酶(EI)進行比較,以期有助于闡明甜菜夜蛾對蟲酰肼的抗藥性機制,為甜菜夜蛾抗性治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

甜菜夜蛾武漢自然(N)種群(抗性比25.29)采于武漢市蔬菜科學研究所實驗田;武漢敏感(CK)種群由武漢市蔬菜科學研究所無毒飼養多年獲得;處理種群用按一定濕重比混勻蟲酰肼(處理濃度為敏感種群的致死中量0.14 mg/kg)的帶毒飼料飼喂的甜菜夜蛾CK種群;汰選種群由武漢敏感種群開始篩選,共篩選了4～6代。

1.2 供試藥劑及試劑

20%蟲酰肼懸浮劑,美國陶氏益農公司;牛血清白蛋白,Roche 分裝 ;固藍 RR 鹽 、α-乙酸萘酯 、β-乙酸萘酯、丙烯酰胺、甘氨酸、β-巰基乙醇、過硫酸銨、溴酚藍、三羥甲基氨基甲烷、甲叉雙丙烯酰胺,Sigma公司;谷胱甘肽S-轉移酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及乙酰膽堿酯酶測試盒,南京建成生物工程研究所;其他常規試劑均為國產。

1.3 蟲酰肼對甜菜夜蛾六類酶活性測定

酶樣品制備、測定方法均嚴格按測試盒說明書操作;數據用DPS軟件處理系統處理;酶活抑制率計算公式：

抑制率=(對照組酶活力-處理組酶活力)/對照組酶活力×100%;

酯酶同工酶電泳：參照張龍翔方法,采用聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠垂直板電泳。

2 結果與分析

2.1 蟲酰肼對甜菜夜蛾 PPO、TCE、GST、SOD和CAT的影響

由表1可知,用混有0.14 mg/kg蟲酰肼的帶毒飼料飼喂CK種群的甜菜夜蛾,在飼喂后24、48 h和72 h測定酶活力,與不用藥處理的CK種群相比,PPO比活力分別降低79.12%、10.54%和56.23%;SOD比活力分別上升71.59%、63.16%和79.55%;GST比活力在處理后24 h酶活力上升41.43%;TCE和CAT比活力差異不顯著。N種群與不用藥處理的CK種群比,PPO比活力降低38.47%;GST比活力升高34.20%;TCE、CAT和SOD比活力差異不顯著。

表1 處理種群、CK種群和N種群的酶活力比較1)

2.2 酯酶同工酶(EI)電泳

CK種群、N種群和汰選種群的酯酶同工酶電泳結果見圖1。

由圖1可知,CK種群與N種群、汰選種群的酯酶同工酶差異極顯著,譜帶的數量、位置、寬度及清晰度均有差異。CK種群酯酶同工酶共15條帶,第2、12、13條帶細且清晰度差,第5和6、7和8條帶近,不易分開;N種群酯酶同工酶共10條帶,第1、9條帶細但清晰,第6、7、8、10條帶清晰度差,第1條帶的位置與其他種群的不同;汰選種群酯酶同工酶共10條帶,第1、7、8條帶清晰度差,第3和4、5和6條帶很近,不易分開;汰選種群中的六汰后第2代(六汰F2)酯酶同工酶共14條帶,即在CK種群第11條帶的位置缺失,第2條帶模糊不清,第12條帶清晰度差。

3 討論

研究表明甜菜夜蛾對蟲酰肼的抗性可能與PPO、EI、GST、SOD 有一定關系,與 CAT 關系不大,與TCE無關。

多酚氧化酶廣泛存在于昆蟲的體壁和血液中,在昆蟲體壁形成的硬化和黑化過程中起重要作用[4-5]。用混有蟲酰肼的帶毒飼料處理試蟲后,處理種群的酶活力均低于CK種群,且在處理后24 h和72 h與CK種群存在顯著差異,表明蟲酰肼很可能可以抑制表皮酚氧化酶酶活力。抗性比為25.29的N種群酶的比活力為9.23A/(mg?min),低于CK種群,且差異顯著,表明N種群的抗性增長與表皮酚氧化酶有關。Retnakaran報道,供試昆蟲在蛻皮中,蟲酰肼抑制了多巴脫羧酶(DDC)的活性,使羽化激素的釋放受到了抑制[6]。在昆蟲表皮鞣化過程中,多酚氧化酶具有單酚酶活性和二酚酶活性,能將酪氨酸羥化,產生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-多巴),然后將多巴氧化成多巴醌,最終生成黑色素,使昆蟲初生的柔軟、色淡的新表皮得以黑化和硬化[5,7-8]。本研究認為,在這一過程中,多巴脫羧酶的活性起著至關重要的作用,加之Retnakaran的報道,這就很好地解釋了蟲酰肼為什么可以抑制表皮酚氧化酶的活性。

處理種群在飼喂帶毒飼料后24、48 h和72 h,表皮酚氧化酶酶活抑制率分別為79.12%、10.54%和56.23%。酶活抑制率產生這種變化的原因可能是藥劑和昆蟲自身調節綜合作用的結果,當殺蟲劑通過昆蟲取食進入蟲體后,就會最大限度地發揮毒殺作用,抑制表皮酚氧化酶的活性;然而昆蟲可以通過自身的調節功能來抵抗這種作用,提高表皮酚氧化酶的活性,在兩者的相互作用達到平衡之前,酶活力的變化就會反復,直到相互作用達到平衡時,酶活力才會出現一個相對穩定值,后續結果有待進一步測試。另外,表皮酚氧化酶的釋放高峰在昆蟲蛻皮時,甜菜夜蛾幼蟲在28℃下平均48 h蛻皮一次,所以這也可能是在試蟲處理后48 h其酶活力與對照無明顯差異的原因之一。

本研究用混有蟲酰肼的帶毒飼料飼喂試蟲后,GST的比活力在飼喂后24 h與CK種群相比差異顯著,與N種群相比差異不顯著,而在飼喂后48 h和72 h GST的比活力與N種群存在顯著差異,與CK種群相比差異不顯著。說明蟲酰肼很可能可以促使甜菜夜蛾的GST酶活力提高,增強其解毒代謝的能力,導致甜菜夜蛾對蟲酰肼抵抗力增強。蘭亦全等報道甜菜夜蛾福州自然種群對蟲酰肼的抗性與谷胱甘肽S-轉移酶有一定關系[9]與本研究相符。

本研究用混有蟲酰肼的帶毒飼料飼喂試蟲后,SOD酶的比活力在飼喂后24、48 h和 72 h均明顯高于CK種群,且差異顯著。表明蟲酰肼很可能可促使甜菜夜蛾SOD酶活力提高,增強其保護功能,提高甜菜夜蛾的抵抗能力。用混有蟲酰肼的帶毒飼料飼喂試蟲后,CAT酶的比活力在飼喂后48 h,與24 h和72 h相比差異顯著,處理種群與CK種群相比差異均不顯著。說明甜菜夜蛾對蟲酰肼的抗性與CAT的關系可能不大。

本研究用混有蟲酰肼的帶毒飼料處理試蟲后,乙酰膽堿酯酶的比活力與CK種群、N種群無差異存在。說明甜菜夜蛾對蟲酰肼的抗藥性與乙酰膽堿酯酶可能無關。酯酶同工酶電泳顯示,N種群、汰選種群(相對抗性種群)與CK種群均存在顯著差異,說明甜菜夜蛾對蟲酰肼的抗藥性與酯酶同工酶可能有很大的相關性。

以上各種酶在用蟲酰肼處理試蟲后不同時間酶活力的變化差異,同樣也可以用藥劑和昆蟲自身調節綜合作用的理論來解釋。

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