人參皂苷Rg3對人成纖維細胞增殖和凋亡影響的實驗研究

劉鶴松,趙自然,蘭珊珊,趙偉剛,王 芳

(1.吉林大學第一醫院 皮膚科,吉林 長春130021;2.吉林大學第一醫院 整形外科,吉林 長春130021;3.白城市醫院 骨科,吉林 白城137000)

瘢痕疙瘩是臨床中常見的疾病,但治療是難題。人參皂甙是人參的有效化學成分,具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[1-3]。本研究是研究人參皂甙Rg3對人成纖維細胞的影響,探究應用其治療瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的可能性。

1 材料與方法

1.1材料取我科瘢痕疙瘩患者手術切取的瘢痕組織。部位:前胸、耳垂等,年齡7-35歲,瘢痕生長時間1-3年,所有患者均無其它器質性疾病,未做過特殊治療及激素治療,均經過臨床和病理診斷證實。

1.1.1主要試劑 GS-Rg3由吉林大學基礎醫學院提供;DMEM培養基美國GIBCO公司;10%滅活小牛血清北京;培養板丹麥;MTT(溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍)北京;二甲基亞砜(DMSO)北京西中化工廠;碘化丙啶(PI)美國Sigma。

1.1.2主要儀器 CO2孵箱美國SHEL LAB;流式細胞儀美國BD;酶標儀美國BIO-RAD。

1.2瘢痕疙瘩成纖維細胞的體外培養和鑒定

1.2.1原代培養 無菌條件下,將手術切除的瘢痕組織放入磷酸鹽平衡溶液中漂洗,用眼科剪刀和手術刀將表皮和皮下組織剔除,反復沖洗干凈后,將真皮組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊,加入2-3滴小牛血清,將組織塊均勻置于培養瓶壁,翻轉培養瓶使組織塊貼壁處朝上加入6 ml含20%胎牛血清的DMEM培養基。每毫升培養液中加入青霉素和鏈霉素各 100 μ,置入 37℃、5%CO2、95%空氣 、飽和濕度的孵箱,孵育12 h,組織塊充分貼壁后,輕輕翻轉培養瓶,使組織塊浸入培養基中,2-3 d換液。

1.2.2傳代培養 7-10 d后可見組織塊周圍有成纖維細胞生長,原代培養的細胞達到80%融合時傳代,按1∶2或1∶3的比例傳代后繼續培養,直至細胞處于對數生長期。

1.3MTT法檢測細胞的活性取第三代細胞,調整濃度為6×104/ml,以每孔50 μ l接種于96孔板,待細胞貼壁后加入不同濃度GS-Rg3。放入 37℃、5%CO2孵箱內分別培養24 h、48 h、72 h,GS-Rg3終濃度為25、50、100 和 200 μ g/ml,對照組加入等量的培養液,每組4復孔。培養12 h后用培養液漂洗細胞2次,每孔加入 MTT(5 mg/ml)10 μ l,繼續培養 4 h后,棄上清,每孔加入 DMSO 100 μ l,振搖 10 min,用Bio-RAD550型酶聯免疫檢測儀在570 nm波長下讀取A值,并計算抑制率。

1.4流式細胞術測細胞周期

1.4.1取第三代細胞,調整細胞濃度為2×105/ml,加入 24 孔板,每孔加 500 μ l(1×105)個細胞 ,待細胞貼壁后加入不同濃度GS-Rg3,37℃、5%CO2孵育24 h后,收集細胞,用PBS緩沖液洗滌2次。

1.4.2加入 PI染色液 200 μ l、Rnase 50 μ l混勻 ,室溫避光作用30 min,孵育。

1.4.3FCM測定細胞周期各時相以及AP區亞峰細胞百分率。

1.5統計學方法用SAS軟件對所有數據進行統計學處理,所有數據均表示為s,陽性率資料組間采用單因素方差分析,P＜0.05值為有統計學意義。

2 結果

2.1劑量-效應關系GS-Rg3不同濃度:25、50、100和200 μ g/ml分別與對照組相比,72 h對細胞增殖的抑制率依次為 33.1%、55.1%、92.8%、82.95%,抑制強度與藥物劑量呈正相關。濃度為100 μ g/ml其抑制率最高,濃度繼續增加,抑制率減弱。

時間-效應關系 貼壁的成纖維細胞在給藥3 h后可見部分細胞脫落,其抑制效應隨時間而明顯增強,72 h處于最高水平。

GS-Rg3濃度在25-100 μ g/ml時對細胞增殖有明顯的抑制作用,但當濃度過高(200 μ g/ml)時對成纖維細胞的生長無明顯的抑制作用,所以選擇50和100 μ g/ml的GS-Rg3進行藥物干預實驗。見表1。

表1 GS-Rg3對體外培養成纖維細胞的抑制率(s,n=4)

表1 GS-Rg3對體外培養成纖維細胞的抑制率(s,n=4)

GS-Rg3(μ g/100ml)抑制率(%)24 h 48 h 72 h F值 P值25 15.57±6.39 16.15±10.6333.1±4.5 1.55 0.269 50 22.3±4.9535.01±3.4455.1±1.1617.518 0.001 100 89.25±2.73 90.05±2.0992.8±1.30 8.924 0.007 200 88.83±2.08 91.45±0.68 82.95±10.228.075 0.010 F值 18.2980 322.987 796.326 P值 0 0 0

2.2體外培養成纖維細胞經GS-Rg3作用24小時后細胞周期變化(s,n=4)G1期細胞比例增多,但S期細胞比例減少,并呈劑量依賴性,G2無明顯改變。見表2

表2 GS-Rg3對細胞周期的影響

2.3流式細胞儀檢測結果GS-Rg3作用的成纖維細胞核內DNA裂解形成凋亡峰;Rg3濃度50 μ g/ml時 ,凋亡率 18.85%;Rg3 濃度 100 μ g/ml時 ,凋亡率25.26%。細胞凋亡比率在一定藥物濃度范圍內,隨藥物濃度的升高而增加。見表3-表5

表3 流式細胞儀測定DNA分布圖(與對照組相比,P＜0.01)

表4 GS-Rg3 50μ g/ml細胞凋亡率18.85%

表5 GS-Rg3 100 μ g/ml細胞凋亡率 25.26%

3 討論

瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是兩種常見的病理性瘢痕,其特征是大量細胞增生和過度膠原沉積,而成纖維細胞是產生膠原的主要細胞[4]。故成纖維細胞與病理性瘢痕形成有重要關系。Kischer等發現肉芽組織向成熟瘢痕過渡中有凋亡發生[5]。使我們想到病理性瘢痕的形成不僅由于成纖維細胞增殖,可能還有成纖維細胞的凋亡減少共同參與。細胞凋亡與細胞產生一樣都是機體自然的生理過程。這種更新是以細胞數量上的恒定為前提的,因此是一種動態平衡;沒有細胞生理性死亡,不可能細胞更新。細胞產生與細胞凋亡之間的平衡是機體穩態的基本條件,它們的平衡一旦破壞,就會導致疾病的產生[6]。

瘢痕疙瘩形成的一個重要因素就是成纖維細胞合成分泌大量細胞外基質[7]。細胞外基質主要是由膠原蛋白、蛋白多糖和纖維粘連蛋白等組成。膠原蛋白主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成,瘢痕疙瘩Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成明顯升高,尤以I型膠原為主[8,9]。采用形態學和免疫細胞化學的方法對體外培養的成纖維細胞進行綜合分析,所培養的細胞為單一的長梭形細胞,以波形蛋白、I型膠原作為成纖維細胞的標志性蛋白進行鑒定,二者均為陽性表達。證實本研究所采用的培養方法是科學合理的,可獲得了高純度的成纖維細胞。

GS-Rg3加入體外培養成纖維細胞中,濃度分別為 0 、25、50 、100、200 μ g/ml,作用時間為 24h 、48h 、72 h。經MTT法檢測發現,GS-Rg3對體外成纖維細胞的抑制率隨濃度的增加和時間的延長而增強,最大抑制率為92.8%,最佳抑制濃度為 100 μ g/ml,因此可見GS-Rg3可抑制成纖維細胞的增殖,且抑制作用呈劑量、時間依賴性。

我們還發現貼壁生長的瘢痕成纖維細胞在給藥后3-4 h可發生部分細胞脫落。為進一步研究其作用機制,進行流式細胞儀檢測GS-Rg3作用的細胞與對照組相比,G1期細胞比例明顯增多,S期細胞比例明顯減少,并呈明顯的劑量依賴性,G2改變無統計學意義。實驗表明GS-Rg3能夠延長細胞由G1期到S期的進程,使細胞阻滯于G1期。S期是細胞進行大量DNA復制的階段,組蛋白及非組蛋白也在此期合成,最后完成染色體的復制,說明GS-Rg3對成纖維細胞生長的抑制,主要是通過抑制DNA合成來完成的。同時通過流式細胞儀檢測到GS-Rg3作用的成纖維細胞核內DNA裂解形成凋亡峰。Rg3濃度50 μ g/ml 72小時時,凋亡率 18.85%;Rg3濃度100 μ g/ml 72小時時,凋亡率25.26%。表明GS-Rg3在一定濃度范圍內可誘導細胞凋亡,并且凋亡比率隨藥物濃度的升高而增加。以上兩個實驗結果說明GS-Rg3可以影響成纖維細胞周期,這一作用是通過抑制細胞的DNA合成來實現的,從而達到抑制成纖維細胞增殖并誘導其凋亡,GS-Rg3可能對瘢痕有治療作用,其機理有待于進一步深入研究。

細胞凋亡時,細胞內DNA裂解,在流式細胞術的DNA圖上呈現亞二倍體核型峰的特征。細胞凋亡一個重要特征就是核酸內切酶激活,引起DNA的廣泛斷裂,這是流式細胞術檢測細胞凋亡的理論基礎。應用DNA特異性熒光染料染色后,凋亡細胞染色程度下降,因此流式細胞術可對DNA含量進行定量分析。在DNA直方圖上,凋亡細胞出現二倍體(G1)峰細胞減少,G1峰左側呈現特征性的亞二倍體(亞G1)峰。而壞死時,細胞周期中的細胞均出現不同程度的減少,亞二倍體細胞量多少不等。亞G1峰可用于凋亡細胞定量。根據Anodrew等[10]的觀點,細胞凋亡是由正常的細胞周期改變引起的,細胞凋亡與細胞周期阻滯有關。應用流式細胞術不僅可以從細胞的形態和特征上分析凋亡細胞,還可以反映細胞發生阻滯的時期。

4 結論

我們的研究表明,GS-Rg3對人成纖維細胞增殖有明顯的抑制作用,并能夠誘導其凋亡,為臨床應用GS-Rg3治療病理性瘢痕提供了理論依據。由于體內外環境的差異以及瘢痕形成的復雜性,其臨床應用價值還有待于進一步研究。

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