吲哚氰綠排泄試驗與參與肝纖維化的細胞因子-TGF-β1mRNA的相關性研究

夏鳳國,范建華

(1.北華大學第一臨床醫院 普外科,吉林 吉林132011;2.北華大學第一臨床醫院 神經內科,吉林 吉林132011)

肝纖維化是慢性肝病最重要的病理特征,也是進一步向肝硬變發展的中間環節。目前研究表明:肝纖維化早期是可逆的。但到后期出現肝硬變時則不可逆,對于肝硬變,目前尚無行之有效的治療措施。目前”肝穿刺”活檢是診斷肝纖維化的金指標,但因其操作有創性,不易反復使用,使其應用受到限制。在”無創”診斷肝纖維化方面,人們已經找到許多與肝纖維化相關的血清標志物,目前臨床上已經將血清TGF-β1的檢測作為診斷早期肝纖維化的指標,但研究表明肝組織中TGF-β1mRNA表達與肝纖維化程度的相關性比血清TGF-β1更密切。故本實驗旨在研究ICG15 min潴留率與細胞因子-β1 mRNA表達的相關性,從基因水平,證明ICG15 min潴留率可以作為診斷早期肝纖維化的一個敏感指標。前期實驗已證明該實驗與肝纖維化病理分期具有很好的相關性。

1 材料和方法

1.1實驗動物清潔級Wistar大鼠52只,雌雄各半,體重180-250 g之間,由吉林大學實驗動物中心提供,清潔級條件喂養,自由進食進水。

1.2試劑吲哚氰綠(ICG),購自沈陽濟世制藥有限公司,國藥準字H20045514;四氯化碳,購自吉林市化學制劑廠;精制玉米油,購自營口渤海油脂工業有限公司。

1.3方法

1.3.1動物分組及模型制備 將52只大鼠隨機分為正常組(10只)和模型組(42只),模型組分四籠喂養。模型組(肝纖維化組),以液體石蠟和精制玉米油2:3配制成40%油溶液,首次以5 ml/kg體重皮下注射,以后3 d一次,3 ml/kg皮下注射。正常組不行任何處置。實驗期間所有大鼠標準飲食。每天觀察大鼠的一般狀況、飲食變化、行為(自主活動、精神狀態)變化、毛發變化。在造模過程中,死亡6只。

1.3.2ICG15分鐘潴留率測定方法ICG濃度按藥物說明書繪制ICG標準曲線。取樣品血漿1 ml加生理鹽水2ml稀釋混勻,752型紫外分光光度計805 nm處測定吸光度。查標準曲線計算出ICG濃度。ICGR15=ICG濃度/1.0×100%.

1.3.3半定量RT-PCR法檢測大鼠肝組織TGF-β1mRNA表達。

TGF-β1上游引物為:5′-GTAGACGATGGGCAGTGGCT-3′;下游引物為:5′-CTGGAAAGGGCTCAACACC-3′;擴增片斷長312bp。內參GAPDH上游引物為:5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′;下 游 引 物 為:5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′;擴增片斷長616 bp。

1.4統計學處理應用SPSS12.0統計學軟件進行數據分析處理,多組變量采用單因素方差分析,多個樣本均數兩兩比較采用q檢驗,采用Pearson相關分析法計算兩組變量相關性分析。

2 結果

2.1動物大體情況觀察

正常組大鼠在實驗進行期間活潑程度、自衛意識、飲食飲水、體毛皮表等無明顯變化,無死亡。造模組大鼠1-4周間無明顯變化,5周以后體毛明顯不順,飲食飲水稍減少,但體重無減輕。造模8周結束后,造模組大鼠死亡2只。以上各組動物經麻醉打開腹腔后,造模8周的大鼠腹腔有腹水,量不等。

2.2肝纖維化形成過程中不同時間ICG15 min潴留率與TGF-β1基因表達變化(見表1)

表1 肝纖維化形成過程中不同時間CG15分鐘潴留率與TGF-β1基因表達變化(s)

表1 肝纖維化形成過程中不同時間CG15分鐘潴留率與TGF-β1基因表達變化(s)

*P＜0.05,**P＜0.01與正常組比較

周數組別樣本量(只)ICG15分鐘潴留率(%)TGF-β1 mRNA量正常組 10 3.51±1.46 0.24±0.02第2周 10 3.62±1.84 0.27±0.02*第4周 10 3.68±1.37 0.36±0.03**第6周 10 7.62±2.14 0.42±0.04**第8周 10 11.82±2.32 0.50±0.06**

2.3細胞因子-TGFβ1基因表達結果見附圖

圖1 實驗性肝纖維化形成過程中 TGF-β1mRNA的表達(半定量 RT-PCR)

2.4ICG15分鐘潴留率與細胞因子-TGFβ1基因表達相關性分析

ICG15分鐘潴留率與細胞因子-TGFβ1基因表達呈正相關,相關系數為:0.909 9(P值均＜0.05)。

3 討論

吲哚氰綠(ICG)是一種暗綠色的無毒色素,副作用極少,其靜脈注射后被肝細胞選擇性攝取,并以原形排入膽汁,其不參與肝腸循環,亦不經腎臟排泄。影響其代謝的主要原因是肝血流量,有功能的肝細胞總數,膽汁的分泌和膽道通暢程度。除上述外,還與血漿蛋白含量、竇側細胞膜通透性、肝細胞內載體蛋白、肝細胞向毛細膽管排泄及轉運能力、毛細膽管以下膽道通暢情況有關。已被應用于肝儲備功能的檢測。根據其代謝特點能夠反映肝纖維化程度成為可能。

細胞因子在肝纖維化發生、發展過程中的作用極為復雜。具有多樣性、雙向性,是當前肝纖維化研究的活躍領域。在眾多的促肝纖維化形成的細胞因子中,轉化生長因子-β1(TGF-β1)是具有多種生物學功能的細胞因子,能夠調節幾乎所有類型細胞的生長、分化和凋亡。它還是重要的免疫調節因子,也是目前發現的最強的致纖維化因子。

1978年De Larco等學者在小鼠肉瘤病毒轉化的細胞株條件培養基中鑒定出具有促進細胞生長和轉化特性的物質,稱之為轉化生長因子(TGF)。后來的研究發現這種 TGF包括兩種成分:TGFα、TGFβ;TGFα具有促進細胞轉化作用,TGFβ與器官纖維化有關。目前研究的轉化生長因子-β,除非特指,一般均指TGF-β1。

3.1轉化生長因子-β的分子結構、受體及作用途徑

轉化生長因子-β1(TGF-β)屬生長因子超家族,哺乳動物組織中存在3種TGF-β亞型(TGF-β1-3)。TGF-β分子由390個氨基酸殘基的前體分子(pre-pro-TGF-β)C端裂解而來。此前體為25kDTGF-β,75kD的潛伏狀態相關肽(LAP)通過二硫鍵連接到潛在TGF-β結合蛋白(LTBP)上[1]。pre-pro-TGF-βN 端的信號肽在分泌前被裂解掉。體內多種因素可導致裂解而活化 TGF-β[2]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)是TGF-β家族中重要的一員,是由兩個結構相同或相近的分子量為12.5KD亞單位借二硫鍵連接而成的雙體結構。

轉化生長因子-β1(TGF-β1)的生物學效應的發揮依賴于細胞表面的受體。幾乎所有的細胞表面都有TGF-β 受體(TβR),TβR 主要有三型:TβRⅠ 、TβRⅡ和TβRⅢ。TGF-β1對細胞外基質的合成和沉積作用主要由Ⅰ型受體介導;TGF-β1通過與細胞表面I型、Ⅱ型受體的結合,形成Ⅱ型受體-TGF-β1-I型受體三聚體復合物,磷酸化后的I型受體將信號放大傳遞給細胞內重要的信號分子Smad,從而產生相應生物學效應[3]。

3.2轉化生長因子-β1合成部位及來源

正常肝臟TGF-β1轉錄見于門靜脈周圍細胞、導管周圍細胞、肝小葉中央靜脈周圍細胞及肝包膜間質細胞。肝纖維化時上述部位的TGF-β1mRNA轉錄增加。Sylke等[4]分離出HSC和肝實質細胞(PC),發現顯示TGF-β1和 LAP彌散分布在PC的胞漿,LTBP的免疫染色主要顯示在漿膜。而TGF-β1、LAP和LTBP在核周更明顯,提示其合成和分泌通過內質網和高爾基復合體完成的。正常情況下,其表達量較少。

國內外的研究證實,TGF-β1與纖維化關系極為密切,但對肝纖維化的不同階段其來源看法不同,大多數學者認為:在肝纖維化早期TGF-β1表達增加主要來源于肝間質細胞,如肝星狀細胞、肌成纖維細胞等,肝實質細胞不表達TGF-β1,但隨著肝纖維化的發展,肝實質細胞、非實質細胞如星狀細胞(HSC)、Kupffer細胞、竇周細胞是肝內TGF-β1的主要產生細胞[5]。本實驗采用RT-PCR方法測定TGF-β1mRNA量,從實驗結果來看,在正常對照組,TGF-β1 mRNA量為(0.24±0.02)較少,表明維持肝臟的正常組織結構需要TGF-β1的參與,才能保持一種動態平衡,這種平衡一旦被打破(如各種損傷因子對肝臟的損傷),TGF-β1mRNA表達量將逐漸增加,并進入惡性循環。模型第2周TGF-β1mRNA表達量為(0.27±0.02)至模型第8周組TGF-β1mRNA量為(0.50±0.06),TGF-β1mRNA量逐漸增加,且各組間差異具有顯著性(P＜0.01);提示CCl4可在轉錄水平上促進TGF-β1的生成,且隨著CCl4注射次數的增多致肝臟損害程度的加重,TGF-β1mRNA量增加更明顯。提示TGF-β1mRNA表達量與肝臟病變發展階段的一致性。與目前公認的結果相同。在此動態觀察TGF-β1mRNA表達過程中,同時測定的ICG15分鐘潴留率也隨著肝臟損害程度的加重而增加,并與TGF-β1mRNA表達量作相關分析,結果兩者呈正相關(相關系數分別為г=0.9099,p值＜0.05),提示ICG15分鐘潴留率與肝臟纖維化形成過程中轉化生長因子-TGF-β1mRNA表達變化的一致性,能夠反映肝纖維化早期肝臟的微觀變化。從參與肝纖維化的細胞因子-TGF-β1mRNA表達的角度驗證ICG15分鐘潴留率能夠診斷早期肝纖維化。

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