人腎細胞癌Notch信號途徑相關基因的表達及其意義

鐘加滕,劉 菲,衣豪偉,孫 琳,于慧美,楊冬艷

(1.吉林大學基礎醫學院病理生理教研室,吉林長春130021;2.吉林大學臨床醫學七年制;3.吉林大學中日聯誼醫院,吉林 長春130033)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是成年人最常見的腎臟惡性腫瘤,而且其發病率仍在逐年增加[1]。腎細胞癌的自然過程極難預料,總的5年生存率很低。Notch信號途徑是通過局部細胞間相互作用控制細胞命運的一種途徑,它在進化中非常保守,在發育過程的調控中發揮重要作用.本實驗對手術獲得的腎細胞癌標本Notch信號通路相關受體、配體mRNA的表達水平進行研究,明確Notch與腎細胞癌的關系,為其作為腎癌篩選標志物提供理論依據,揭示腎細胞癌發生發展的可能分子機制,從而提高治療的合理性和有效性。

1 材料與方法

1.1主要試劑Trizol試劑、RT-PCR試劑盒購自Invitrogen公司;高保真TaqDNA聚合酶、MMV逆轉錄酶、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒均購自大連寶生物工程公司;瓊脂糖購自北京鼎國生物技術有限公司。引物合成由上海生工生物工程技術服務公司完成。溴化乙錠DEPC購自德國Merk公司;dNTP購自Promega公司;其它常規化學試劑均為分析純產品。

1.2標本獲取與保存超聲引導下穿刺活檢及手術獲得2007年9月至2009年5月到中日聯誼就診并被診斷為腎細胞癌的患者的腎細胞癌標本,將收集好的標本立即放入液氮中保存。

1.3RT-PCR 檢測Notch信號通路受體Notch-2、Notch-3和Notch信號通路配體 Jagged-1、Delta-1mRNA水平液氮研磨組織塊,用TRIzol試劑提取組織中的總RNA,采用逆轉錄酶和Oligo d(T)18、dNTP將總 RNA逆轉錄成 cDNA,之后取 1 μ l進行 PCR(Takara)反應。以GAPDH為內參照,引物序列及PCR產物片斷大小見表1,PCR反應條件:Notch-2、Jagged-1和 Delta-1為30循環 ,變性 94℃、30 s,退火55℃、30 s,延伸 72℃、30 s;Notch-3 為 30循環,變性94℃、30 s,退火 56℃、30 s,延伸 72℃、30 s;GAPDH為28 循環,變性 94℃、30 s,退火 58℃、30 s,延伸72℃、30 s。擴增產物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分析(上海天能科技有限公司GIS凝膠成像系統),以目的基因電泳條帶密度值灰度×面積與內參GAPDH比值確定其含量。

1.4統計學分析結果以s表示,采用SPSS 13.0統計學軟件對8例癌癥組織和癌旁組織標本中Notch信號通路分子的表達水平進行統計學分析,各項檢測指標比較采用t檢驗。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1Notch信號通路受體Notch-2 mRNA水平的RTPCR的結果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Notch-2 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結果見表2,差異有統計學意義,其中三例標本的RT-PCR電泳結果見圖1。

2.2Notch信號通路受體Notch-3 mRNA水平的RTPCR的結果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Notch-3 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結果見表2,差異有統計學意義,其中三例標本的RT-PCR電泳結果見圖1。

2.3Notch信號通路配體Jagged-1 mRNA水平的RT-PCR的結果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Jagged-1 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結果見表2,差異有統計學意義,其中三例標本的RT-PCR電泳結果見圖1。

2.4Notch信號通路配體Delta-1 mRNA水平的RTPCR的結果顯示與癌旁組織相比,癌癥組織中Delta-1 mRNA水平明顯升高(P＜0.01),結果見表2,差異有統計學意義,其中三例標本的RT-PCR電泳結果見圖1。

Fig.1 The Notch-2、Notch-3、Jagged-1and Detla-1 mRNA expression in kidney carcinoma tissue

2.58例電泳結果的灰度值比較見表2

3 討論

Notch信號途徑是通過局部細胞間相互作用控制細胞命運的一種途徑,它在進化中非常保守,在發育過程的調控中發揮重要作用。哺乳動物有4種Notch受體(Notch1-4)和5種配體(Jagged1,2和Delta 1,3和4)。在正常情況下Notch信號轉導系統能調節細胞對分化信號的識別能力,在調控細胞生長分化、組織更新及調節細胞內環境穩定中發揮重要作用。人類許多實體瘤及血液系統腫瘤均發現Notch1受體的異常表達[2-6],越來越多證據表明Notch1與腫瘤發生有關。但在不同腫瘤細胞中的具體表現又有明顯的不同,Notch信號途徑在腫瘤細胞中具有雙重特性。多數研究結果顯示Notch具有促癌作用,但也有文獻報道為抑癌作用。Tonon等[7]闡述了Notch作為癌基因在信號通路中的作用,而Nicolas等[8]則提出在鼠皮膚癌發生中,Notch1為抑癌作用而不是促癌作用。此外,還有研究證明人的乳腺癌中,Notch1常與腫瘤的發生有關,而Notch2與腫瘤的抑制有關[9]。與之相反,人的腦腫瘤中,Notch1與腫瘤的抑制有關而Notch2與腫瘤的發生有關[10]。這是由于大多數腫瘤表達不只一種Notch配體和/或受體,因此這些配體/受體總的表達最終決定Notch信號是促進腫瘤的發生還是抑制腫瘤的發生。

表2 8例腎細胞癌標本Notch信號途徑分子表達水平

目前對于腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)的發生發展與Notch信號通路的關系的研究在逐漸增多,最新的研究表明[11],Notch信號通路在RCC的發生發展過程中發揮著重要的作用,本實驗的研究結果顯示,Notch信號通路的受體Notch-2、Notch-3以及Notch信號通路的配體Jagged-1在癌癥組織中的表達有了明顯的升高,提示Notch信號通路與RCC的發生呈現出一定的相關性,為其作為腎癌篩選標志物提供一定的理論依據。但是明確Notch信號通路與RCC發生發展之間的關系還需要做進一步研究。

[1]Sweeney JP,Thornhill JA,Graiger R,et al.Incidentally detected renal cell carcinom a:pathological features,survival trends and implications for treatment[J].BrJU rol,1996,78(3):351.

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[7]Tonon G,Modi S,Wu L,et al.t(11;19)(q21;p13)translocation in mucoepidermoid carcinoma creates a novel fusion product that disrupts a Notch signaling pathway[J].Nat Genet,2003,33(2):208.

[8]Nicolas M,WolferA,Raj K,et al.Notch1 functions as a tumor suppressor inmouse skin[J].Nat Genet,2003,33(3):416.

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[10]Fan X,Mikolaenko I,Elhassan I,et al.Notch1 and notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth.Cancer Res.2004;64:7787.

[11]Sun S,Du R,Gao J,et al.Expression and clinical significance of Notch receptors in human renal cell carcinoma.Pathology,2009,41(4):335.