Syk基因轉(zhuǎn)染對人結(jié)腸癌細胞系影響的實驗研究

于慶功,?；埯?李明強,舒 敏,王 偉,劉春英

(大連大學附屬中山醫(yī)院消化科,遼寧大連116001)

Syk(Spleen tyrosine kinase)是一種B細胞激活信號轉(zhuǎn)導中最重要的激酶[1]。近來對Syk與腫瘤相關(guān)性研究證實,Syk可以抑制多種惡性腫瘤的生長,從而引發(fā)了對非受體酪氨酸激酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中作用的研究。腫瘤的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移是多階段、多因素的復雜過程,其中逃避免疫監(jiān)視則是最為重要的環(huán)節(jié)之一[2]。因此,分析與Syk基因有關(guān)的抗腫瘤免疫活性,探討因Syk表達缺失而導致的腫瘤免疫逃逸作用及其機制具有十分重要的價值。本研究將Syk基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,在脂質(zhì)體作用下將該載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸腺癌細胞LoVo,檢測該細胞的生長周期變化。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸腺癌細胞系LoVo購自中國科學院上海細胞庫。DH5α,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCX為本室保存。PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR擴增試劑盒、DNA連接試劑盒和限制性內(nèi)切酶購自寶生物大連有限公司 。TRIzolTM Reagent、Lipofectamin、Genecitin 購自GIBCO BRL公司。

1.2 方法

1.2.1目的基因的聚合酶鏈反應(PCR)按TR I-zol試劑盒說明書提取脾臟組織總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒操作說明擴增Syk cDNA。根據(jù)Gen-Bank中登錄的Syk cDNA序列設(shè)計引物,上游引物序列為:5′2CACC ATG GCC AGC AGC GGC ATGGCT G23′,下游引物序列為 :5′2GTT CAC CAC GTC ATA GTAGTA ATT GCG23′。hGAPDH PCR 引物:5′-TCC TCT GAC TTC AAC AGC GAC ACC-3′和 5′-TCT CTC TTC CTC TTG TGC TCT TGG-3′。擴增產(chǎn)物用 5 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2Syk基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建 收集脾臟組織細胞,一步法提取細胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以特異引物進行PCR擴增,其擴增長度為1909bp。循環(huán)參數(shù)為:預變性94℃1分鐘,變性98℃10秒;退火55℃30秒;延伸72℃1分鐘,循環(huán)30次,后延伸72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別用Cla I和Hind III雙酶切,在T4DNA連接酶作用下進行目的基因cDNA片段克隆,構(gòu)建成Syk基因的真核表達載體,命名為pLNCX-Syk。質(zhì)粒pLNCXSyk轉(zhuǎn)化到DH5?感受態(tài)菌,通過PCR、酶切鑒定重組,采用ABI PRISMTM 377(Perkin Elmer)型全自動測序儀進行測序。

1.2.3pLNCX-Syk轉(zhuǎn)染LoVo細胞 pLNCX-Syk質(zhì)粒經(jīng)Lipofectamine介導轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞。轉(zhuǎn)染后36小時,加入 Genecitin(200 μ g/ml)篩選細胞。篩選7天,挑出耐受新霉素而能生長的陽性克隆命名為pLNCX-Syk+,此時空白對照細胞全部死亡。Genecitin終濃度改用100 μ g/ml擴增培養(yǎng)陽性克隆5周后,用于以下實驗。空質(zhì)粒載體pLNCX轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞的陽性克隆命名為pLNCX-Syk-,作為陰性對照。

1.2.4Southern blot分析 為了檢測外源基因是否整合于結(jié)腸癌細胞基因組之中,選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上的抗性基因——新霉素(Neo)基因編碼區(qū)片段作為探針進行雜交,探針大小為770 bp。選擇Neo基因編碼區(qū)兩側(cè)的EcoR I和BamH I酶切位點,對基因組DNA進行酶切。提取細胞基因組DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上,以Neo為探針進行雜交。

1.2.5轉(zhuǎn)染細胞中Syk基因轉(zhuǎn)錄的檢測 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引物經(jīng)計算機網(wǎng)上檢索確認與人類細胞基因組無同源性,所以細胞基因組中如果沒有外源載體引物基因,RT-PCR結(jié)果將為陰性。如有載體引物基因mRNA轉(zhuǎn)錄,RT-PCR將為陽性結(jié)果。使用載體引物,RT-PCR鑒定Syk基因mRNA在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應體系中以DEPC水代替AMV作為陰性對照。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收片段并純化,以載體引物為測序引物,對上述片段進行測序。

1.2.6細胞生長倍增時間的測定 接種細胞(1×104/孔)于24孔板中,每隔24h對每種細胞的3個孔進行消化計數(shù),求平均值。細胞倍增時間計算方法:培養(yǎng)96小時后計數(shù)的細胞數(shù)=接種的細胞數(shù)×2n(n=細胞96小時的增殖倍數(shù)),細胞倍增時間(小時)=96/n

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pLNCX-Syk的鑒定

重組質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Cla I和HindⅢ雙酶切,1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶與設(shè)計大小一致[圖1]。應用pLNCX載體引物進行目的基因測序,測序結(jié)果與Gene Bank(AF015950)完全一致,沒有發(fā)生堿基突變。

2.2 Southern雜交鑒定

用EcoRⅠ和BamH Ⅰ雙酶切,可切下包含Neo基因編碼區(qū)的DNA片段。因此,以Neo基因編碼區(qū)片段作為探針進行雜交,可以檢測到分子量在1 900 bp左右的雜交帶[圖2]。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX和pLNCX-Syk質(zhì)粒的LoVo細胞均有雜交帶,而未轉(zhuǎn)染的細胞沒有雜交帶。說明外源Syk基因已整合到LoVo細胞基因組。

2.3 轉(zhuǎn)染細胞中Syk基因mRNA水平的檢測

提取轉(zhuǎn)染細胞的總 RNA,應用載體引物進行RT-PCR檢測,結(jié)果表明Syk基因在mRNA水平有轉(zhuǎn)錄,而陰性對照則沒有轉(zhuǎn)錄[圖3]。同時將RT-PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收片段并純化,以pLNCX載體引物為測序引物進行測序,結(jié)果與設(shè)計序列完全一致,再次證明外源Syk基因在細胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄。

2.4 細胞生長分析

pLNCX-Syk+細胞較pLNCX-Syk-細胞生長明顯緩慢,pLNCX-Syk-細胞的倍增時間為30-33小時,而pLNCX-Syk+細胞倍增時間延長至68-72 h,說明對結(jié)腸癌細胞的生長有明顯的抑制作用。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖2 Southern雜交鑒定

圖3 轉(zhuǎn)染細胞中Syk基因mRNA水平的檢測

3 討論

人類Syk編碼基因為Syk基因,位于人類染色體9q22,蛋白質(zhì)分子量為72 KD,由629個氨基酸組成,是一種非受體型的酪氨酸激酶,在B細胞的成熟和活化過程中起關(guān)鍵性作用[3]。Syk在自體磷酸化部位含有兩個Src同源功能區(qū)SH2(N)和SH2(C),與T細胞激活中的ZAP-70屬于同一個蛋白酪氨酸激酶(PTKs)家族,是磷酸化ITAM(依賴酪氨酸的免疫受體活化基序)招募的首選對象,與之結(jié)合后而激活,進而啟動B細胞活化信號轉(zhuǎn)導途徑,激活各種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位進入細胞核,使相應基因產(chǎn)物表達,調(diào)整B細胞等細胞克隆的蛋白質(zhì)表達、細胞分化或凋亡[4]。Syk基因的表達缺失會致T、B淋巴細胞活化障礙,失去了對異化細胞的監(jiān)測作用,從而導致腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移[5,6]。研究發(fā)現(xiàn),Syk不但是免疫調(diào)節(jié)因子,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤的發(fā)病過程中存在著Syk表達缺失的現(xiàn)象。Coopman等發(fā)現(xiàn)Syk是促進乳腺上皮細胞生長的強力因子,他們通過正常乳腺組織和乳腺癌的原位雜交實驗驗證了Syk在正常乳腺上皮細胞和正常乳腺上皮細胞株MCF10A中表達,在原位癌中表達受抑制,而在有典型惡性表現(xiàn)(高轉(zhuǎn)移性和侵襲性)的乳腺癌中表達缺失,進而提出Syk表達缺失與腫瘤的發(fā)生存在相關(guān)性[7]。Sada等認為Syk是一種候選抑癌基因,Syk的表達缺失會致免疫細胞發(fā)育、成熟障礙,重者會導致重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID),由于機體免疫細胞的成熟障礙,機體的免疫監(jiān)測力下降,對突變、異常增生的細胞失去免疫力,從而導致腫瘤易發(fā)[8,9]。

大腸癌惡性生物學特性的表達是依賴于多因素影響和多基因調(diào)控的,抑癌基因在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益受到重視。楊祖立等采用巢式雙重甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)和RT-PCR方法檢測120結(jié)直腸癌病例探討Syk基因啟動子甲基化與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)120例結(jié)直腸癌患者中,48例未檢測到Syk mRNA的表達,而癌旁正常組織均有表達;37例腫瘤組織發(fā)生Syk基因啟動子甲基化,癌組織Syk基因啟動子甲基化顯著高于正常組織;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的56例中,24例發(fā)生Syk基因啟動子甲基化,而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的64例中,13例發(fā)生甲基化,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Syk基因啟動子甲基化發(fā)生率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,而發(fā)生甲基化的腫瘤組織中均無SykmRNA的表達,說明基因甲基化可以導致Sykm-RNA的表達缺失,進而引起結(jié)直腸癌的侵襲性增強,這可能是結(jié)直腸癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的又一種機制[10]。本實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Syk cDNA的LoVo細胞比轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染的細胞倍增時間顯著延長,提示Syk基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過外源Syk基因mRNA水平的表達,從而抑制人結(jié)腸腺癌細胞的生長。

Syk在大腸癌中的作用機制、表達缺失的原因以及Syk如何抑制腫瘤細胞侵襲生長與轉(zhuǎn)移的具體機制等尚不清楚。有研究認為HER 2的過度表達可以使內(nèi)皮細胞收縮,內(nèi)皮細胞間隙增寬,使腫瘤細胞易于從內(nèi)皮細胞穿越,從而易于使腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。Syk與HER 2的作用相反,其抑制癌的轉(zhuǎn)移可能是通過拮抗HER2的作用,擴張內(nèi)皮細胞,減少內(nèi)皮細胞間隙來實現(xiàn)。綜合上述研究表明Syk對大腸癌的生長和轉(zhuǎn)移可能有抑制作用,進一步研究Syk基因的作用機制,可為大腸癌的治療提供新的思路。

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