產ESBLs和AmpC酶陰溝腸桿菌的檢出率及耐藥性監測

邵良榮,邵 杰,居會祥,孫明中,陳思聰

(1.東南大學醫學院附屬鹽城醫院,江蘇鹽城224001;2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院,江蘇南京210046)

對超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的研究雖已有二十多年歷史,但由于它們作用底物廣、易播散、數量種類不斷增加、個體差異大,對臨床治療造成很大威脅,使得對這些酶的研究持續至今天。近年來,ESBLs更是在幾乎所有腸桿菌科細菌及以外細菌中都有檢出。陰溝腸桿菌亦不例外。2001年-2004年我們已對產ESBLs陰溝腸桿菌的臨床分布、及耐藥情況進行了研究[1]。鑒于此,我們又對2005-2007年中所收集的陰溝腸桿菌中ESBLs檢出率及耐藥狀況進行進一步研究,同時對產AmpC酶的陰溝腸桿菌的檢出率及耐藥狀況進行研究,希望能更全面的了解目前產ESBLs陰溝腸桿菌狀況。

1 材料與方法

1.1實驗用菌株為2005-2007年本院收集的陰溝腸桿菌。質控菌:大腸埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC700603。產AmpC酶的陰溝腸桿菌EB131標準菌由有關公司惠贈。

1.2實驗藥品阿莫西林、棒酸、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、舒巴坦、頭孢托侖、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星、莫西沙星、頭孢他啶紙片、頭孢他啶/棒酸紙片、頭孢噻肟紙片、頭孢噻肟/棒酸紙片、頭孢西丁紙片、頭孢曲松紙片、頭孢西丁/APB,頭孢噻肟/APB、頭孢泊肟、頭孢泊肟/棒酸、。以上紙片均為Oxoid公司產品。

1.3致病菌鑒定實驗所用菌株均經API鑒定系統復核鑒定。

1.4陰溝腸桿菌產ESBLs和AmpC酶的檢測

1.4.1AmpC酶檢測

1.4.1.1APB酶抑制劑增強試驗[2]將濁度為0.5 MacFarland的受試菌菌液接種于Mueller-Hinton瓊脂平面,將頭孢噻肟,頭孢他啶,頭孢西丁,頭孢噻/APB,頭孢他啶/APB,頭孢西丁/APB紙片分別貼于Mueller-Hinton平皿上,37℃培養16-18 h后觀察結果。頭孢他啶/APB-頭孢他啶,頭孢噻肟/APB-頭孢噻肟,頭孢西丁/APB-頭孢西丁抑菌圈直徑相差大于或等于5 mm判定為酶抑制劑增強試驗陽性,即細菌產AmpC酶。

1.4.1.2AmpC酶的誘導試驗[3]將濁度為0.5 Mac Farland的受試菌菌液接種于Mueller-Hin-ton瓊脂平面,作為誘導劑的IPM紙片貼于Mueller-Hinton平皿中央,作為指示劑的頭孢吡肟,頭孢噻肟,頭孢噻肟/棒酸,頭孢他啶/棒酸紙片貼于IPM紙片周圍,各指示劑紙片與IPM紙片中心相距25 mm,37℃培養16-18 h后觀察結果,任一指示劑紙片近IPM一側出現抑菌環被切割的現象,判斷為陽性,即該菌株為誘導型產AmpC酶菌株。

1.4.1.3去阻遏型AmpC酶檢測 參照Park YJ等人文獻[4]操作,即按CLSI推薦的K-B法進行頭孢他啶,頭孢噻肟,頭孢西丁的藥敏試驗,三種藥全耐藥判定為細菌產去阻遏型AmpC酶。

1.4.1.4DHA型AmpC酶編碼基因的PCR擴增PCR擴增引物和反應條件參照文獻[5]。

1.4.2ESBLs的檢測 雙紙片增效法(DDS)試驗:用M-H瓊脂平板(Oxoid英國)以及含和不含棒酸(10 μ g)的頭孢噻肟(30 μ g)或頭孢他啶(30 μ g);含和不含棒酸(1 μ g)的頭孢泊肟(10 μ g)藥敏紙片(Oxoid英國)。對于頭孢噻肟、頭孢他啶如果含棒酸和不含棒酸抑菌區直徑相差大于5 mm,對于頭孢泊肟含棒酸和不含棒酸抑菌區直徑相差大于4 mm,就視為ESBLs陽性[6]。

1.5數據分析采用WHONET25.3軟件。按照CLSI/NCCLS2007文年軟件M1002S17規定的折點判定耐藥(R)、中介(I)和敏感(S)。

2 結果

2.1陰溝腸桿菌體外抗菌試驗結果81株陰溝腸桿菌對19種抗菌藥物的耐藥率見表1。

2.281株陰溝腸桿菌產ESBLs和/或AmpC酶藥敏試驗結果,將ESBLs和AmpC酶檢出率分別與頭孢曲松、頭孢噻肟和頭孢他啶藥敏試驗聯合分析,結果見表2。

表1 81株陰溝腸桿菌對19種抗菌藥物的耐藥率比較

3 討論

2001年-2004年我們已對產ESBLs陰溝腸桿菌的臨床分布、及耐藥情況進行了研究。本次研究的結果表明,ESBLs在陰溝腸桿菌中的檢出率達到35.0%,較上次34.6%略高。但對其又作了進一步研究,耐藥情況亦作了更進一步的研究。,其中單純產ESBLs的菌株占到一半(14/28),占整個陰溝腸桿菌的17.3%。在佘丹陽的報告中[7],陰溝腸桿菌ESBLs檢出率為23.6%,其中單產ESBLs的比例是10.4%。這一比例高于國外文獻報道的2.9%[8],原因有待進一步探詢。但可以說,除了AmpC酶,陰溝腸桿菌耐藥還有一部分是由于ESBLs所引起。將產酶情況和藥敏結合分析發現,單純產AmpC酶的菌株,對所測第三代頭孢菌素有很強的耐藥性。既產ESBLs又產AmpC酶的菌株耐藥情況較嚴重。而單產ESBLs的菌株,絕大部分對頭孢曲松和頭孢噻肟中介;對頭孢曲松和頭孢噻肟耐藥的占40%以上,有一小部分(不到三分之一)對頭孢他啶敏感,但敏感率高于頭孢曲松和頭孢噻肟,估計這與其所產ESBLs類型密切相關。將ESBLs和AmpC酶檢出率分別與頭孢曲松、頭孢噻肟和頭孢他啶藥敏結果聯合分析發現:對頭孢曲松中介的14株陰溝腸桿菌中ESBLs的檢出率高達92.9%,是AmpC酶檢出率的兩倍多。但在對頭孢曲松耐藥的27株菌中,情況剛好相反,AmpC酶的檢出率(88.9%)是ESBLs檢出率(40.7%)的兩倍多。頭孢噻肟中介和耐藥株中兩酶的檢出情況與頭孢曲松相似。頭孢他啶只有1株中介株;敏感株中兩酶的檢出率略高于頭孢曲松和頭孢噻肟;耐藥株中AmpC酶檢出率(78.4%)約是ESBLs檢出率(56.8%)的1.4倍。由此可見,在陰溝腸桿菌中,對頭孢曲松和頭孢噻肟中介的菌株,以產ESBLs為主,耐藥菌株以產AmpC酶為主。提示對陰溝腸桿菌中ESBLs的監測研究很有必要。

表2 陰溝腸桿菌部分藥敏試驗產酶情況(%)

體外抗菌試驗結果提示,碳青霉烯類抗生素、第四代頭孢菌素頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦對AmpC酶和ESBLs均為穩定的β內酰胺類抗生素,可用于治療產AmpC酶、ESBLs菌引起的重癥感染。但碳青霉烯類抗生素為治療首選。

[1]邵良榮,王國政,孫明中,等.產ESBLs陰溝腸桿菌的臨床分布及耐藥性研究[J].中華醫院感染學雜志,2006,16(1):105.

[2]沈定霞,羅燕萍,曹敬榮,等.肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因的研究[J].中華醫院感染學雜志,2006,16(8):850.

[3]Zhouzh,Li Lj,Yuys,et al.Thestatus of drugresis tanceandamp Cgeneexpressionin Enterobactercloacae[J].Chinese Medical Journal,2003,116(8):1244.

[4]ParkYJ,ParkSY,OhEJ,etal.Occurrenceofexte-nded-spectrumβ-lactamasesamongchromosomalAmpC-producingEnterobacter cloacae,Citrobacterfreundii,and Serratiamavcescens in Korea and in-vestigation of screening criteria[J].Diagnostic Mi-crobolgy and Infectious Disease,2005,51:265.

[5]Perez-perez FJ,Hanson ND.Detection of plasmidme-diated AmpCβ-lactamase genes in clinical isolates byusing multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2002,40(6):2153.

[6]Clinical and Laboratory StandardsInstitute.Perfor-mance standardsforantimicrobial susceptibility test-ing;sixteenth informational supplement[S].CLSIdocument M100-S16.CLSI Wayne Pa,2006.

[7]佘丹陽,劉又寧.AmpC酶和超廣譜β-內酰胺酶在陰溝腸桿菌中的表達及對其耐藥性的影響[J].中華醫學雜志,2002,82(19):1355.

[8]SpanuT,LuzzaroF,PerilliM,etal.Occurrence of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae in Italy implications for resistance toβ-lactams and other antimicrobial drugs[J].AntimicrobA-gentsChemother,2002,46(1):196.