拜阿司匹靈預處理對高血糖SD大鼠局部腦缺血再灌注損傷中ET-1的表達

宋妮娜 高 政 孫文芳 姜麗杰

大連醫科大學附屬第二醫院北院神經內科 大連 116031

缺血性腦血管病是人類的常見病、多發病,致死率與致殘率均很高,嚴重影響人類生活質量。缺血性腦血管病患者發病時多伴有血糖的升高,使腦缺血的治療更加復雜。本研究旨在通過預防性應用拜阿司匹靈,觀察在高血糖狀態下,SD大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積,內皮素-1(Endothelin-1,ET-1)的表達情況,并探討高血糖狀態下,拜阿司匹靈預處理后對大鼠腦缺血再灌注損傷是否有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共36只,體質量180～220 g,血糖正常(＜6 mmol/L),術前禁食12 h。按隨機化原理分為2組:對照組(n=18)、拜阿司匹靈(n=18),各組按缺血90min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分為3個亞組。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥方法:拜阿司匹靈組大鼠在手術前3 d灌胃,劑量為6mg/kg。

1.2.2 大鼠高血糖模型制備:在阻斷大鼠大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)前30min均腹腔注射50%葡萄糖溶液(3 g/kg)。栓線前取鼠尾血一滴,用血糖儀測定血糖值＞11.1 mmol/L表示模型建立成功。

1.2.3 參照改良的 Longa-Zea氏線栓法[1]:制作大鼠大腦中動脈(MCA)閉塞的腦缺血模型。于栓塞90min拔出栓線實行再灌注,分別于再灌注后 3 h、6 h、24 h(每個亞組 6只)處死動物。

1.3 觀察指標

1.3.1 腦梗死體積的測定:過量水合氯醛腹腔注射麻醉致大鼠死亡,迅速斷頭取腦速凍15min,經視交叉水平行冠狀切片(共A、B、C、D、E 5個腦片),C片常規做石蠟包埋,用做免疫組化和HE染色,其余腦片行T TC染色。各腦片在同等條件下用數碼相機正反面拍照,采用病理圖像分析儀系統測定每片梗死面積及該片總面積,按公式:〔(各片正反面梗死面積之和/2)×片厚〕/〔(各片正反面總面積之和/2)×片厚〕×100%計算出梗死體積/大腦體積百分比,以此作統計分析。

1.3.2 免疫組織化學法測定ET-1的表達:將腦片C置于10%多聚甲醛中行外固定,72 h后常規石蠟包埋,行冠狀切片,片厚4 μm,切片貼附于經APES處理的載玻片上,用SP免疫組織化學方法測定ET-1的表達。每張切片在10×20倍顯微鏡下隨機選取缺血區內4個不重疊的視野,計數ET-1陽性微血管數。

2 結果

腦梗死體積測定:在相同再灌注時間點,拜阿司匹靈組較對照組腦梗死體積明顯降低(P＜0.01)。見表1。免疫組化結果:在相同再灌注時間點,拜阿司匹靈組較對照組ET-1陽性表達明顯降低。見表2。

表1 腦梗死體積在2組再灌注各時間點的比較(梗死體積/總體積百分比)

表2 ET-1在2組再灌注各時間點的表達結果

3 討論

腦缺血再灌注損傷的機制包括一系列復雜的級聯反應,包括細胞內鈣超載、炎癥反應、興奮性氨基酸的毒性作用,凋亡相關基因的表達、自由基的形成、線粒體功能紊亂等。這些因素相互作用引起神經元的死亡。

高血糖能加重腦缺血損傷。在腦缺血損害很短時間內,葡萄糖過多,發生無氧酵解,從而使細胞乳酸過多堆積而發生酸中毒,加重神經細胞和神經膠質細胞的損害;此外腦缺血時高血糖能顯著引起內皮細胞形態的改變,內皮細胞線粒體功能障礙[2]。阿司匹林作為臨床常用藥,在缺血性腦血管病治療與二級預防中的神經保護作用,已得到臨床醫生的廣泛共識。但是在腦缺血再灌注和高血糖雙重損害下,拜阿司匹靈是否也具有神經保護作用尚不明確。本研究發現,在高血糖狀態下,在相同的再灌注時間點,拜阿司匹靈組較對照組梗死體積明顯減小,我們可以通過觀察ET-1的表達探討拜阿司匹靈在高血糖狀態下,減小梗死體積的分子機制,即在高血糖狀態下,拜阿司匹靈的神經保護作用。

內皮素是目前所知最強的長效血管收縮劑。神經組織、神經膠質細胞、血管內皮細胞中存在有ET。ET-1主要在血管內皮細胞表達,在神經系統的內皮細胞及神經細胞內也有廣泛分布。腦缺血及缺血再灌注后 ET-1均有增加。ET-1的損傷機制可能有:(1)促進胞內鈣釋放和胞外鈣內流,使胞內鈣超載以及引起微循環障礙。(2)引起中性粒細胞聚集黏附。(3)增加氧自由基的產生[3]。(4)使腦組織代謝增加,興奮性氨基酸釋放增多,細胞內Na+-H+交換增多,細胞酸中毒,加重腦損害[4]。(5)導致內皮細胞的自穩態失衡。(6)破壞血腦屏障的完整性,引起腦水腫[5]。

周慶博等[6]研究發現,在正常血糖下,阿司匹林能夠抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注后ET的分泌。拜阿司匹靈為生物利用度高的腸溶性阿司匹林,本實驗發現,在高血糖狀態下,再灌注各時間點,拜阿司匹靈組較對照組ET-1表達明顯減少,腦梗死體積縮小,差異顯著。因此認為,在高血糖狀態下,拜阿司匹靈仍能夠抑制ET-1的表達,從而起到神經保護作用。TXA2可能與ET-1引起的血管收縮反應有密切關系,所以拜阿司匹靈可能通過抑制TXA2的生成,進而抑制ET-1的表達;阿司匹林能夠增強內皮細胞抗氧化損傷的能力,改善內皮細胞功能,進而抑制內皮細胞生成ET-1;此外阿司匹林能增強內皮細胞中NO合成酶的表達,使NO釋放顯著增加,拮抗 ET-1的合成。

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]Keep RF,Andjelkovic A V,Stamatovic SM,et al.Ischemia-induced endothelial cell dysfunction[J].Acta Neurochir Suppl,2005,95:399-402.

[3]Kasemsri T,Armstend WM.Endothelin production links superoxide generation to altered opioid-induced pial artery vasodilation after brain injury in pig s[J].Stroke,1997,28(1):190-196.

[4]Kita S,Katsuragi T.Endothelin-1 enhances the activity of Na+/Ca2+exchanger ty pe 1 in renal epithelial cell[J].J Cardiovasc Pharmacol,2004,44:S239-S243.

[5]Lo AC,Chen AY,Hung VK,et al.Endothelin-1 overex pression leads to further water accumulation and brain edema after middle cerebral artery occlusion via aquaporin 4 expression in astrocy tic end-feet[J].J Cereb Blood Flow M etab,2005,25(8):998-1011.

[6]周慶博,邵念方,李莉,等.阿司匹林對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中血NO、ET、TNF含量的影響[J].臨床神經病學雜志,2002,15(6):326-328.