移植的嗅鞘細胞在大鼠正常和挫傷脊髓內的遷移

張立仁,葉超群,孫天勝,包建玲,劉彥

嗅鞘細胞因可促進軸突再生和髓鞘形成被認為是促進脊髓損傷修復的理想候選細胞,并在臨床試驗中顯示出了初步安全性。但其促進神經功能恢復的效果并不理想,甚至存在較大分歧。為了系統研究嗅鞘細胞在促進脊髓損傷修復中的作用,我們采用來源于7日齡綠熒光Sprague Dawley(SD)大鼠嗅鞘細胞,對其在大鼠正常脊髓和損傷脊髓內的遷移情況進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (75±1)日齡SPF二級雌性SD大鼠12只:微通利華實驗動物中心;New York University(NYU)打擊器:美國新澤西大學W.M.Keck中心提供;恒溫冷凍切片機、立體定位儀、微量顯微注射器、環胞霉素注射液、共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡;來源于7日齡綠熒光SD大鼠的嗅鞘細胞:北京西山醫院神經外科研究室提供;鼠源抗髓磷脂相關蛋白(myelin basic protein,MBP)單克隆抗體(SMI-199):Covance;鼠源抗神經絲(neurofilment,NF)單克隆抗體(N0142):Sigma;二抗為Alexa熒光羊抗鼠488。兔源抗膠質纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體:Dako;鼠源抗S-100單克隆抗體::Sigma;二抗為Alexa熒光羊抗鼠633、羊抗小鼠488和羊抗大鼠488。二抗均為分子探針公司(Molecular)產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 上述大鼠隨機分組,均接受嗅鞘細胞移植。正常組:按制作脊髓損傷模型方法暴露T8-10脊髓,不實施打擊,直接在T9脊髓注射細胞;脊髓損傷中心組:制作脊髓損傷模型后將嗅鞘細胞移植于損傷部位中心;脊髓損傷臨近組織組:制作脊髓損傷模型后將嗅鞘細胞移植于距損傷部位中心1 mm處的頭側、尾側脊髓中線上。

1.2.2 模型制作 依據Gruner的方法[1]利用NYU打擊器制作脊髓損傷模型:0.4%戊巴比妥鈉(35±5)mg/kg腹腔注射麻醉,以T10棘突為中心常規備皮、消毒、鋪巾,以T10棘突為中點作長約1 cm的縱行切口,逐層剪開皮膚、筋膜、鈍性分離椎旁軟組織,暴露T8-10棘突和椎板,游離T10椎板上下緣,咬去T10椎板和T9椎板的下半部分,暴露硬膜,固定 T8和 T11棘突并使大鼠懸空;接通打擊器電路,調節打擊高度為25 mm打擊,大鼠立即出現一過性鼠尾擺動和后肢痙攣;逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚;術后1周內每日給予青霉素2×105U肌注2次,每日排尿1次,常規飼養。

1.2.3 細胞移植

1.2.3.1 細胞準備 移植前30 min開始消化、洗滌細胞,用不含血清的DMEM將細胞稀釋成濃度為1×105/μ l的懸液。

1.2.3.2 細胞注射 每個部位注射4個點,深度為1.75 mm 、1.25 mm 、1 mm 、0.5 mm;每點注入 0.5 μ l嗅鞘細胞懸液,注射速度為0.1 μ l/min,每點注射完畢后留針5 min。自移植前 1 d每天給予環胞霉素10 mg/kg皮下注射,直至取材。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 細胞遷移 移植后1周取材。4%多聚甲醛心臟灌注固定,迅速取出脊髓后,將脊髓分為以損傷部位(正常組以注射位點)為中心長15 mm、頭側10 mm、腰段10 mm以及尾側2 mm脊髓段,恒冷箱冰凍切片機上分別行冠狀和橫切片,片厚10 μ m,每隔8張取1張,直接貼在預先用0.1%明膠處理過的載玻片上(每張載玻片貼6張切片)。每組均取第2套切片觀察細胞遷移,其他切片-80℃保存,1個月內分別完成免疫熒光染色。

第2套切片用 PBS漂洗10 min/次,共3次,晾干后熒光顯微鏡下觀察細胞遷移。

1.3.2 移植細胞的鑒定 每組均取第1套切片,利用GFAP/S-100免疫熒光雙染進行移植細胞鑒定。主要步驟:從-80℃冰箱內取出切片復溫后,0.01 mol/L PBS漂洗 10 min/次,共 3次,含 10%山羊血清的0.1%PBST常溫封閉2 h,加入相應滴度的一抗(GFAP:1∶400,S-100:1∶100),4℃濕盒過夜,0.01 mol/L PBS漂洗10 min/次,共3次,熒光二抗(1∶400)常溫孵育2 h,漂洗、晾干后封片。

1.3.3 NF和MBP免疫熒光染色 每組均分別取第3、4套損傷部位切片分別進行NF和MBP免疫熒光化學染色[2]。主要步驟同上,其中一抗滴度:NF:1∶400,MBP:1∶200。

2 結果

2.1 一般情況 所有大鼠均存活良好。脊髓損傷大鼠在傷后0～5 d可見明顯的口周和眼周充血和血尿;正常大鼠在術后1～3 d可見活動減少,步態不協調。未見其他不良反應。

2.2 移植嗅鞘細胞的遷移 移植后1周時,移植于正常脊髓內嗅鞘細胞主要沿脊髓縱軸方向從注射位點向兩側在白質和灰質內遷移,部分細胞突起與脊髓縱軸一致,絕大部分遷移細胞排列無規則(封三彩圖1.1)。移植于脊髓損傷部位中心的嗅鞘細胞主要圍繞注射位點沿脊髓縱軸呈橢圓形分布,占據損傷部位并分布于其周圍的脊髓內,小部分在白質內向頭側和尾側遷移,遷移距離較短(封三彩圖1.2)。移植于距離損傷部位頭側和尾側1 mm處的嗅鞘細胞的主要在白質和灰質內沿脊髓縱軸向損傷部位遷移,還分別有一小部分沿中央管遷移(封三彩圖1.3)。

2.3 移植細胞的鑒定 S-100和GFAP免疫化學雙染結果顯示:部分嗅鞘細胞表達S-100,部分同時表達S-100和GFAP。(封三彩圖1.4)

2.4 移植嗅鞘細胞促進MBP和NF表達 脊髓損傷部位切片上可見紅色的MBP(封三彩圖1.5)和NF(封三彩圖1.6)陽性纖維伴隨嗅鞘細胞的遷移而延伸,說明移植的嗅鞘細胞可以促進髓鞘形成、軸突再生并為軸突延伸提供“支架”。

3 討論

嗅鞘細胞移植是目前脊髓損傷修復研究領域的熱點,而移植細胞存活是移植策略促進脊髓損傷修復的前提。本文觀察了嗅鞘細胞在正常脊髓和損傷脊髓不同部位的遷移特點,結果顯示:移植的嗅鞘細胞可在脊髓內遷移。

早在1998年,Ramon-Cueto就發現,急性期移植的嗅鞘細胞在全橫斷損傷脊髓內沿3條途徑遷移:①主要沿脊髓縱軸方向在白質和灰質內遷移;②一部分在中央管和蛛網膜下腔遷移[3]。我們在脊髓挫傷大鼠亞急性期移植也發現了相同的遷移特點[2]。來自成人和成年大鼠鼻黏膜的嗅鞘細胞在正常脊髓和脊髓半橫斷模型大鼠脊髓內也表現出相似的遷移能力[4]。

然而,在 T10水平脊髓壓迫模型[5]、脊髓挫傷模型[6]、脊髓全橫斷模型[7]均有報道未見移植細胞的遷移。Lu等利用大鼠脊髓橫斷模型,將嗅鞘細胞、骨髓基質細胞、成纖維細胞等移植于損傷部位的頭側和尾側脊髓,發現所有細胞都能在移植后1 h內發生“遷移”,在移植后24 h到達損傷部位,且細胞間的“遷移”沒有差別。他們認為,這種遷移是由于注射壓力作用下的被動擴散,并非細胞的主動遷移;在大鼠脊髓背側束損傷后,嗅鞘細胞并不能成功橋接皮質脊髓束纖維長過損傷區[7]。

對于上述研究結果的差異,Pearse認為與細胞移植的時間不同有關:傷后立即移植,在瘢痕未形成前,細胞可能從注射部位遷移出去;傷后1周的延期移植可能因損傷脊髓內膠質界面的形成或各種胞外基質的存在,如硫酸軟骨素糖蛋白、tenascins粘蛋白、可溶性chemorepellant分子,或與星型-腦膜成纖維網之間的生理作用影響細胞遷移至宿主正常的脊髓組織[6]。Plant的研究則顯示,傷后立即或傷后7 d將嗅鞘細胞植入適度挫傷模型,盡管嗅鞘細胞被反應性膠質包圍很少遷移至周圍組織,但還是形成移植物,P75的免疫化學染色顯示移植物內有大量的內源性施萬細胞,影響了嗅鞘細胞的遷移[8]。上述結果提示:移植環境是影響細胞遷移的重要因素。但是,本研究室的系列研究顯示,無論是在急性期還是在亞急性期(傷后2～3周)、無論是單獨的嗅鞘細胞還是聯合施萬細胞移植時,嗅鞘細胞可以發生遷移,且遷移途徑相似,說明細胞的遷移取主要決于其本身特性。已有研究證實,體外培養的嗅鞘細胞在不同的時間可自動分化為不同的亞型,不同亞型嗅鞘細胞的具有不同的遷移能力[9]。

因此,為了促進移植嗅鞘細胞在脊髓內的遷移,應選擇合適的移植時機(細胞培養時間、細胞移植時間),并結合其他的方法改善移植環境,如聯合硫酸軟骨素酶的應用等。

本研究結果還顯示,移植的嗅鞘細胞可促進MBP和NF表達,說明移植的嗅鞘細胞可促進軸突再生和髓鞘形成,數量少可能與移植時間較短,細胞未能充分發揮功能有關。進一步的研究正在進行之中。

[1]Gruner JA.A monito red contusion model of spinal cord injury in the rat[J].J Neurotrauma,1992,9(2):123-126,126-128.

[2]葉超群,孫天勝,高爾鏡,等.不同方法共移植的嗅鞘細胞和雪旺細胞再損傷脊髓內的遷移和促進軸突再生[J].中國脊柱脊髓雜志,2010,2.

[3]Ramon-Cueto A,Plant GW,Avfla J,et al.Long-distance axonal regeneration in the transected adult rat spinal cord is promoted by olfactory ensheathing glia transplants[J].J Neurosci,1998,18(10):3803-3815.

[4]Deng C,Gorrie C,Hayward I,et al.Survival and mig ration of human and rat olfactory ensheathing cells in intact and injured spinal cord[J].J Neurosci Res,2006,83(7):1201-1212.

[5]Boyd JG,Lee J,Skihar V,et al.LacZ-expressing olfactory ensheathing cells do not associate with myelinated axons after implantation into the compressed spinal cord[J].PANS,2004,101(7):2162-2166.

[6]Pearse DD,Sanchez A R,Pereira FC,et al.T ransplantation of Schwann cells and/or olfactory ensheathing g lia into the contused spinal cord:Survival,migration,axon association,and functional recovery[J].Glia,2007,55(9):976-1000.

[7]Lu P,Yang H,Culbertson M,et al.Olfactory ensheathing cells do not exhibit unique migratory or axonal growth-promoting properties after spinal cord injury[J].J Neurosci,2006,26(43):11120-11130.

[8]Plant GW,Currier PF,Cuervo EP,et al.Purified adult ensheathing glia fail to myelinate axons under culture conditions that enable Schwann cells to fo rm myelin[J].J Neurosci,2002,22:6083-6091.

[9]Huang ZH,Wang Y,Cao L,et al.Migratory properties of cultured olfactory ensheathing cells by single-cell migration assay[J].Cell Res,2008,18(4):479-490.