Src蛋白在肝癌HepG2細胞增殖凋亡中作用的初步研究

毛成毅,鄭繼軍,杜 娟,馬 瑜,林 俐,李增鵬,陳 芳

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所:1.病理科;2.腫瘤中心,重慶400042)

原癌基因Src在調節正常細胞的生長、發育、增殖和凋亡等方面發揮著重要作用,其異常表達和腫瘤的發生、發展密切相關。在人類許多腫瘤中(如結腸癌、乳腺癌和胰腺癌)都存在Src蛋白的過度表達和活化。肝癌細胞的浸潤、轉移是臨床上治療肝癌失敗的重要因素。近年來國內外研究表明,許多肝癌組織中存在高度活化的Src蛋白,然而其在肝癌中的作用還未完全闡明[1-3]。本文中應用免疫組化、流式細胞術以及MTT法檢測Src蛋白在HepG2細胞中的表達以及細胞增殖和凋亡情況,同時用特異性Src蛋白酪氨酸激酶抑制劑PP2作用于肝癌細胞株HepG2細胞,研究Src蛋白對肝癌細胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)人肝癌細胞株HepG2細胞由第三軍醫大學西南醫院感染科惠贈;(2)DMEM培養基,小牛血清,胰蛋白酶,PBS;(3)兔抗人單克隆抗體Src(Cell Signaling公司);(4)PP2(Calbiochem公司);(5)羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗(北京中杉公司);(6)SP免疫組化試劑盒(北京中山公司);(7)MTT,DMSO(Sigma公司);(8)倒置顯微鏡(Olympuls公司);(9)6、96孔細胞培養板,細胞培養瓶(Corning公司);(10)CO2細胞培養箱(Thermo公司);(11)AnnexinV/FITC及PI試劑盒(北京晶美生物有限公司);(12)DMN-9602酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)。

1.2 免疫組化染色 取對數生長期人肝癌細胞株HepG2細胞,以0.25%胰酶消化傳代后,加至24孔板中經酸和乙醇處理的蓋玻片上。待HepG2細胞在蓋玻片表面貼附適當后,置37℃、5%CO2孵箱孵育 24h 后,按照 5、10、20、40μ mol/mL 4種濃度PP2分別加入培養板中,繼續培養4h后,倒去培養基,加95%酒精室溫固定30min后取出蓋玻片用DPX粘在載玻片上,4℃冰箱過夜。用3%過氧化氫處理10min,再用PBS洗后,依次滴加一抗(1∶300,37℃恒溫箱孵育40min)、增敏劑、辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶300,37℃恒溫箱孵育30min)。PBS洗后,以 DAB顯色、蘇木素襯染,然后常規脫水、封片,用光鏡觀察結果。

1.3 M TT法檢測PP2對HepG2細胞增殖的抑制作用 取對數生長期的細胞,經胰酶消化后吹打成單細胞懸液,調整濃度為5×105/mL,接種于 96孔培養板中,每孔 200μ L。24h后,棄原培養液,按照 5、10、20、40μ mol/mL 4種濃度的 PP2 加入新培養液,每種濃度設3個平行復孔,另設陰性對照組。置37℃、5%CO2培養48h,各孔加入 MT T(5mg/mL),繼續培養4h,棄上清液,然后加入DMSO,振蕩 10min,用酶標儀檢測OD值(波長=490nm)。根據下列公式計算各濃度對HepG2細胞增殖的抑制率:平均細胞增殖抑制率IR=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100%。以抑制劑濃度為橫坐標,增殖率為縱坐標,繪制細胞增殖曲線。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集不同濃度PP2處理48h的HepG2細胞,常規胰酶消化后,制成單細胞懸液,離心后棄上清液,再經預冷的 PBS洗2次,按 AnnexinV/FITC及 PI試劑盒提供方法依次加入結合緩沖液、AnnexinV/FITC及PI,4℃避光30min后上機測試。采用FACScort流式細胞儀對樣品進行檢測,每次計細胞數10 000個,激發波長488nm,用分析軟件Cell Quest計算凋亡率。

2 結 果

2.1 Src蛋白在HepG2細胞中的表達 Src蛋白陽性表達定位于HepG2細胞的細胞漿,陽性著色為棕黃色顆粒狀。PP2抑制劑 5、10、20、40μ mol/mL 分別處理 HepG2 細胞后,Src 蛋白在HepG2細胞中表達降低,棕黃色顆粒狀減少,顏色變淺,見圖1。

圖1 正常HepG2細胞、陰性對照及不同 PP2濃度下Src蛋白在HepG2細胞中表達情況

2.2 細胞凋亡分析 PP2作用于HepG2細胞 48h后,流式細胞儀檢測到細胞凋亡,且細胞凋亡率隨著PP2濃度增高而增高。處理組與對照組之間差異有統計學意義(P＜0.01),低濃度組與高濃度組間差異有統計學意義(P＜0.01),見圖2。

圖2 PP2誘導HepG2細胞凋亡情況

圖3 不同濃度PP2對HepG2細胞增殖抑制作用

2.3 M TT法檢測PP2對HepG2細胞增殖的抑制作用HepG2細胞經PP2抑制劑 5、10、20、40μ mol/mL 4種濃度作用48h后,隨著抑制劑濃度的增加,抑制作用明顯增加,呈現濃度依賴性,5、10、20、40μ mol/mL 4 種濃度的抑 制率分別為39.66%、48.00%、64.63%、76.89%,低濃度組(5、10μ mol/L)與高濃度組(20、40μ mol/L)相比差異有統計學意義(P＜0.05),見圖 3。

3 討 論

肝細胞性肝癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,隨著慢性肝炎、肝硬化發生率的提高,HCC的發病率也不斷上升。雖然目前肝癌診斷治療水平有提高,但其治療效果仍不理想。因此,需要進一步闡明HCC的發病機制。近年來,許多證據表明癌基因Src蛋白在肝癌的發生和發展中起著重要的作用。Src蛋白是由原癌基因c-Src編碼的一個相對分子質量為60kd的磷酸化蛋白質,是第1個被發現具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌蛋白。Src蛋白在調節正常細胞的發育、增殖和凋亡等方面發揮著重要作用。在惡性腫瘤細胞中Src蛋白大量聚集在核周,而在正常的細胞內Src蛋白相對均勻的散布于細胞質內。目前研究發現Src蛋白在結腸癌中活性極高,尤其是在腫瘤轉移到肝臟之后[4-7]。

本實驗證明了Src蛋白在人肝癌HepG2細胞中高表達,Src酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2抑制HepG2細胞中Src蛋白酪氨酸激酶后,Src蛋白在人肝癌HepG2細胞中表達降低,細胞中棕黃色細顆粒狀減少。HepG2細胞被Src酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2抑制后,培養的肝癌細胞偽足減少,增殖顯著降低,呈現劑量依賴性,隨著抑制劑濃度的升高細胞增殖隨之降低。作者發現,應用特異性Src蛋白酪氨酸激酶抑制劑PP2能夠抑制HepG2細胞,使 Src蛋白失活,從而抑制HepG2細胞的增殖。并且隨著抑制劑濃度的增加和對Src蛋白的抑制增強,HepG2細胞增殖抑制率上升。

Src蛋白過度表達或活化對腫瘤細胞的生長影響還不是十分清楚。有研究發現,應用反義寡核苷酸減少Src蛋白表達,能夠抑制HT29結腸癌細胞的體外和體內的生長。本研究表明,活化的Src蛋白在肝癌細胞株HepG2細胞凋亡中發揮重要作用,抑制Src蛋白磷酸化,能夠抑制HepG2細胞的增殖,增強細胞凋亡。但是,不同的腫瘤,或者同一腫瘤的不同類型,Src蛋白對細胞增殖凋亡影響是不同的[8-11]。

Src蛋白作為胞質內蛋白,其過表達與相當多腫瘤疾病(乳腺癌、肝癌、結腸癌和肺癌等)有關,有研究認為其與生長因子有協同作用,具有癌基因活性。其可被整合素受體、生長因子受體等細胞膜受體激活,從而激活不同的信號通路,引起細胞增殖、凋亡多種生理效應。Src蛋白家族可對Fak起調節作用,通過色氨酸同源區域(SH)連接其他胞內蛋白激酶,引起激酶鏈反應。整合素受體耦聯ECM與胞內肌動蛋白骨架,ECM與整合素受體的結合促使整合素β亞基的胞質端形成黏著斑,并誘發Src-Fak復合體的形成及黏著斑蛋白的磷酸化,激活PI-3K,引起細胞的黏附、遷移。尤其是在腫瘤轉移期,Fak與Src蛋白關系更加密切[9-12]。

綜上所述,Src蛋白在人肝癌細胞株HepG2細胞增殖和凋亡過程中起重要作用。Src蛋白可以通過其自身多個位點同多種蛋白直接作用,影響肝癌細胞增殖、凋亡、浸潤和轉移等多種生物學行為,提供了針對Src蛋白靶點對肝癌進行分子靶向治療的理論依據。僅可以開拓它本身的應用領域,還可為設計更理想的新藥提供新的獨特的化學結構,后者可被用為創制新藥的先導化合物,經驗表明這種做法可以更經濟的篩選發現新藥。在抑制腫瘤的同時,有研究認為該藥物還具有逆轉多藥耐藥的作用。本實驗結果也證實姜黃素同時可以在體外有效逆轉某些實體瘤(乳腺腺癌 MCF-7/ADR)和白血病(急性早幼粒細胞白血病HL60/ADR)細胞系的多藥耐藥,姜黃素組和阿霉素組的敏感性分別比對照組增加3.39倍和4.18倍。根據RT-PCR和Western Blot檢測結果,其逆轉靶點可能為M RP基因,同時細胞系的凋亡也可能通過Bcl-2蛋白途經得到了加強。腫瘤細胞的多藥耐藥機制很多,但一般認為藥泵是其主要并且是最易進行逆轉的途徑;Mdr1以及MRP基因的編碼產物為藥物轉運蛋白通過外排泵作用使細胞內藥物濃度下降導致耐藥[9-10],通過RT-PCR檢測發現MRP基因在兩種耐藥細胞系中表達均有所下調,而流式細胞儀檢測加入姜黃素后的細胞內阿霉素熒光強度明顯高于單獨使用阿霉素的試驗組,說明姜黃素可能通過抑制轉運蛋白的藥泵功能使藥物有效進入細胞內部達到治療的結果。同時其抑制效應不但作用于實體瘤細胞而且作用于白血病細胞系,提示姜黃素的作用不僅僅是針對某一類腫瘤(實體和血液病),其具有較好的廣譜逆轉效應。實驗同時顯示,姜黃素對耐藥細胞系有明顯的促凋亡作用,并對Bcl-2蛋白的表達有所抑制。姜黃素能否在體內試驗中同樣逆轉多藥耐藥,以及是否通過促進凋亡以及抑制藥泵在體內起到逆轉耐藥作用還需進一步研究。

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