胰島素和丁酸鈉對自發性高血壓大鼠血管平滑肌細胞組蛋白乙酰化及增殖相關基因和蛋白的影響

傅春江,何作云,王旭開△,楊成明,王紅勇,方玉強,石偉彬,韓 愈,何多芬

(第三軍醫大學:1.大坪醫院心內科,重慶400042;2.新橋醫院心內科,重慶400037)

我國人群高血壓(EH)的患病率呈持續增長趨勢,大量研究證實,高血壓合并糖尿病及高胰島素血癥的患者,發生心腦血管并發癥的風險大大高于單純高血壓患者。研究還證實,胰島素可促進血管平滑肌細胞(VSMC)中bFGF、TGF-β、PDGF、Matrix Gla和OPN等細胞增殖及表型相關基因及蛋白高表達,而決定VSMC表型的a-SM卻是低表達,表明胰島素促進VSMC異常增殖的同時還伴有VSMC表型改變。那么VSMC是通過何種方式引起這些基因表達差異的呢?目前尚缺乏相關研究。既往對胰島素引起血管平滑肌細胞異常增殖的研究,多從細胞轉錄因子(如AP-1等),應答基因轉錄、翻譯及結構基因本身改變等方面入手。近年來,基因外修飾,特別是組蛋白修飾對基因的表達調控有了重要的進展,提出了“組蛋白密碼”的假說:即結構基因表達的開放與關閉與組蛋白修飾-染色質重構有關。胰島素可以促進VSMC增殖,這種作用和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路密切相關,在胰島素引起VSMC增殖的過程中,是否通過了組蛋白修飾,以及MAPK是否參與了這種修飾,目前還不清楚,這正是本研究所要探討的。

1 材料和方法

1.1 材料 自發性高血壓大鼠(SHR)購自北京阜外醫院;胎牛血清和DM EM購自Gibco公司;PD98059購自Promega公司;羊抗鼠抗體、羊抗兔抗體、兔抗羊抗體購自Sigma公司;胰島素購自德國Roche公司,抗MAPK抗體、抗α-SM actin抗體購自Sigma公司;抗 HDAC1抗體、抗H3賴氨酸乙酰化抗體購自Cellsignaling公司;抗 PDGF抗體、抗骨橋蛋白(OPN)抗體購自Santa公司;β-actin抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 VSMC的分離培養及分組 采用純種4周齡雄性SHR,分離主動脈,去除內膜與外膜,用貼塊法分離培養VSMC,經免疫組化鑒定,6～10代的VSMC用于研究。實驗分為6個組。(1)空白對照組(C組):不加任何干預;(2)胰島素組(insulin組):加入終濃度為10-7mol/L胰島素作用;(3)PD98059組:加入終濃度為 10-5mol/L PD98059;(4)丁酸鈉組(Na組):加入終濃度為10-3mol/L丁酸鈉;(5)胰島素聯合PD98059組(insulin聯合 PD98059組):PD98059預處理30min后,再加入同樣濃度的胰島素;(6)胰島素聯合丁酸鈉組(insulin聯合Na組):丁酸鈉預處理 30min后,再加入同樣濃度的胰島素。以上各組胰島素均作用24h。

1.2.2 VSM C蛋白質提取 按1×108cells/L細胞數接種于25cm2培養瓶中,用含10%小牛血清DMEM培養基培養,貼壁生長后換含1%小牛血清DMEM培養基靜置培養24h。將靜置培養的VSMC細胞按組別分別加或不加PD98059、丁酸鈉,孵育30min后每孔加或不加胰島素;孵育24h后棄去培養基,冷PBS漂洗,0.25%胰酶消化,4 000r/min、2min,棄上清液,冷PBS漂洗,4 000r/min、2min,棄上清液。4℃下在細胞沉淀中加入細胞裂解液(cell lysis buffer 100μ L+PMSF1μ L),4℃下1h充分裂解。取上清液分裝、保存。DU 800 Spectrophotometer建立蛋白質濃度曲線后測定蛋白質樣品濃度。

1.2.3 免疫印跡 提取的蛋白質按100μ g上樣,9%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,125V,90min分離蛋白質125V,125mA,1h轉印至PVDF膜。TBST漂洗3次,每次5min,TBS配置的5%脫脂奶粉封閉 2h。用抗 MAPK、α-SM actin和 OPN、HDAC1、PDGF、H3賴氨酸乙酰化抗體進行檢測。

2 結 果

2.1 胰島素和丁酸鈉對MAPK的影響 經胰島素刺激后,VSMC的MAPK表達明顯增加,這與前面實驗結果一致,而用丁酸鈉和PD98059預處理后,胰島素促進MAPK的表達作用明顯減弱(P＜0.05),在未給予胰島素干預情況下,PD98059對VSM C M APK的表達亦有降低作用(P＜0.05)(圖1)。

圖1 胰島素和丁酸鈉對MAPK的影響

2.2 胰島素和丁酸鈉對HDAC1的影響 用胰島素作用于VSMC,結果顯示胰島素可上調HDAC1的表達,說明胰島素對組蛋白乙酰化/去乙酰化產生了影響。這種作用可被丁酸鈉所阻斷,但PD98059對胰島素作用后的HDAC1無明顯影響,說明胰島素促進HDAC1表達并沒有通過MAPK途徑,而丁酸鈉組HDAC1的表達最低,提示丁酸鈉對生理情況下SHR VSMC HDAC1蛋白質的表達即有抑制作用(圖2)。

2.3 胰島素和丁酸鈉對H3賴氨酸乙酰化的影響 經胰島素作用后,SHR VSMC H3乙酰化賴氨酸(Lys9)的表達較正常對照組升高(P＜0.05),而 PD98059可使正常對照組 H3乙酰化賴氨酸的表達減弱,同時抑制胰島素對H3乙酰化賴氨酸的上調作用,說明胰島素促進H3賴氨酸乙酰化的作用通過MAPK途徑。丁酸鈉可使SHR VSMC H3乙酰化賴氨酸的表達明顯升高,提示丁酸鈉可明顯促進VSMC H3的乙酰化(圖3)。

圖2 胰島素和丁酸鈉對HDAC1的影響

圖3 胰島素和丁酸鈉對H3乙酰化賴氨酸的影響

2.4 胰島素和丁酸鈉對PDGF的影響 免疫印跡結果顯示胰島素組PDGF的表達明顯高于其他組(P＜0.05),PD98059及丁酸鈉預處理后,與胰島素組比較這種作用受到明顯的抑制(P＜0.05)(圖4)。

圖4 胰島素和丁酸鈉對PDGF的影響

2.5 胰島素和丁酸鈉對α-SM actin的影響 免疫印跡結果顯示胰島素組α-SM actin的表達明顯低于其他組(P＜0.05),PD98059及丁酸鈉預處理后,這種作用受到明顯的抑制與胰島素組比較(P＜0.05)(圖 5)。

2.6 胰島素和丁酸鈉對OPN的影響 免疫印跡結果顯示胰島素作用后OPN的表達較空白對照組明顯增強(P＜0.05),PD98059及丁酸鈉預處理后,OPN的表達明顯減弱,與胰島素組比較差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 6)。

圖5 胰島素和丁酸鈉對α-SM actin的影響

圖6 胰島素和丁酸鈉對OPN的影響

3 討 論

丁酸鈉是HDAC抑制劑,通過抑制HDACs的活性,引起組蛋白超乙酰化。國內外大量研究證實丁酸鈉對許多種細胞的異常增殖能夠起到抑制作用,并且丁酸鈉已經應用于腫瘤的臨床研究。但是關于丁酸鈉對高胰島素血癥時VSMC的異常增殖作用研究得較少。本研究發現,在丁酸鈉預處理后,胰島素促進VSMC增殖的作用受到明顯抑制,說明組蛋白的超乙酰化同樣對VSMC異常增殖具有抑制作用。在丁酸鈉處理后,結果顯示H3組蛋白賴氨酸乙酰化與其他組相比明顯增強,這和國外的相關研究結果一致。同時本研究發現,在使用胰島素刺激后,H3組蛋白賴氨酸表達亦增強,為什么都是組蛋白賴氨酸乙酰化增強而胰島素的作用表現促進細胞增殖,而丁酸鈉的作用是抑制細胞增殖呢?組蛋白乙酰化可以中和組蛋白所帶正電荷,從而減弱核小體中堿性氨基酸與DNA的靜電吸引力,降低其與帶負電荷DNA鏈的親和性,降低相鄰核小體之間的聚集,使DNA與組蛋白空間位阻增大,兩者間的相互作用減弱,DNA易于解聚,染色質呈轉錄活性結構,因此有利于轉錄因子與DNA模板相結合,增加轉錄因子的進入進而激活基因轉錄[1]。本研究也發現細胞增殖相關基因PDGF在胰島素的作用下表達明顯升高,同時伴隨H3賴氨酸乙酰化增強,說明H3賴氨酸乙酰化使得PDGF基因活化。關于細胞增殖相關因子PDGF是目前研究得比較多的,大量的研究證實PDGF促進VSMC的增殖,這種現象在腫瘤細胞也得到證實,胰島素促進VSMC增殖和很多癌基因的激活相關,癌基因激活后又可通過增殖相關因子的激活從而使細胞增殖。因此,丁酸鈉可能對VSMC的增殖存在抑制作用。丁酸鈉抑制細胞增殖的原因在于其使組蛋白超乙酰化,有研究證實組蛋白乙酰化促進細胞增殖,但組蛋白的超乙酰化反而抑制細胞增殖,研究發現丁酸鈉可以下調增殖相關細胞核抗原(PCNA)、視網膜母細胞瘤敏感蛋白p130(pRb)、細胞分裂控制蛋白2同系物(cdc2),細胞周期素(cyclin)B1、細胞分裂控制蛋白 20同系物(p55cdc),HMG1、2以及其他細胞增殖相關基因的表達,上調cyclin D1、p21WAF1、p141NK4B/p15INK5B、叢集蛋白等增殖抑制基因的表達。同時丁酸鈉還對應激相關蛋白如熱休克蛋白(HSP)、細胞色素P450,血管功能調節蛋白存在影響[2]。丁酸鈉還對GST-P1在核上的定位存在影響,同時下調應激氧化蛋白[3],從而抑制VSMC的增殖。因此,丁酸鈉抑制細胞增殖和兩方面因素有關:(1)組蛋白的超乙酰化抑制了增殖相關基因的轉錄;(2)組蛋白的這種超乙酰化促進抗癌基因及增殖抑制基因的轉錄活性,且這種作用具有腫瘤相關基因特異性,其具體機制目前不清。使用丁酸鈉處理后,組蛋白的超乙酰化對MAPK也起到抑制作用,MAPK作為細胞信號轉導通路在VSMC增殖過程中扮演著重要的角色[4],胰島素促進VSMC增殖其中的重要一條通路就是MAPK途徑已經得到較廣泛地認同。

本研究發現,丁酸鈉明顯抑制MAPK蛋白的表達。這可能是丁酸鈉抑制胰島素促VSMC增殖的一個重要機制。在本研究中發現一個有趣的現象,胰島素雖然促進H3組蛋白乙酰化,但對HDAC1的作用卻是增強的。HDAC1是組蛋白去乙酰化酶之一,可以使組蛋白去乙酰化,從理論上講,HDAC1的增強應該使組蛋白去乙酰化增強,乙酰化減弱,但本研究的結果卻顯示胰島素促進HDAC1的表達。作者分析這可能和兩方面因素有關:(1)組蛋白的去乙酰化是HDAC家族共同作用的結果,每一種HDAC對結合在DNA上的組蛋白靶點是不同的,胰島素可能對不同的HDAC具有不同的作用;(2)胰島素促進了H3組蛋白的乙酰化,是否在VSMC內存在著一種反饋平衡機制,使得HDAC1的活性反而增強呢?以上只是推測,具體機制有待進一步探討。在阻斷MAPK后并不能抑制胰島素促進HDAC1的作用,說明胰島素促進HDAC1的表達沒有通過MAPK途徑。因為細胞信號轉導通路有很多種,如蛋白激酶A(PKA),蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇-3(羥基)激酶(PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)通路等。胰島素的這種作用有可能通過了其他途徑。

本研究還證實,PD98059可以阻斷胰島素促進H3的乙酰化作用,說明在VSMC中,胰島素對H3的乙酰化作用是通過了MAPK信號通路的。在H3乙酰化減弱的同時伴隨VSMC增殖的抑制,說明H3乙酰化對VSMC的增殖具有重要意義。H3乙酰化增加的同時細胞也發生了表型的轉化,在VSMC中α-SM actin作為收縮型的標志,而OPN和基質蛋白作為合成型的標志。研究發現VSMC增殖的同時往往伴隨這些蛋白的變化,因此,一部分研究者也把α-SM actin和OPN含量的變化作為細胞增殖的一個指標。VSMC的主要特點是在成熟的血管組織中并非是其終末分化狀態,因此在某種條件下其表型可以被調節。VSMC去分化狀態和表型的改變被認為是在動脈粥樣硬化和新生內膜過度增殖過程中血管壁重構的重要方面。分化狀態的VSM C呈紡錘形,增殖和收縮能力均很低;而去分化狀態的VSMC呈菱形或上皮細胞樣,具有較高的增殖能力和遷移能力,其蛋白水解活性也增加,而細胞支架和收縮蛋白含量降低,并且對凋亡誘導刺激的敏感性增加[5]。

胰島素可促使PDGF上調,PD98059和丁酸鈉均可阻斷胰島素對VSMC的這種作用,說明組蛋白的超乙酰化通過某種途徑抑制了PDGF的表達,組蛋白的乙酰化/去乙酰化改變在胰島素促VSMC增殖的過程中起著重要的調控作用。

本研究發現胰島素促使α-SM actin下調的同時使OPN上調,且這種作用能夠被PD98059和丁酸鈉阻斷,因此,一方面說明胰島素的這種作用通過了MAPK通路,另一方面說明結構基因的外修飾即組蛋白的乙酰化/去乙酰化改變影響了這些蛋白質的表達。從機制上推測,組蛋白的超乙酰化抑制了某些增殖及表型轉化相關基因,使得VSMC的增殖受到抑制,從而升高α-SM actin和下調OPN。據此,作者認為,胰島素是否通過這樣一個途徑而引起VSMC增殖的呢?即胰島素→MAPK細胞信號轉導系統→組蛋白乙酰化改變→相關增殖基因(如PDGF)活化→細胞增殖和表型轉化。但其中許多具體環節尚待進一步研究。在臨床上,冠脈內支架植入術已被廣泛地應用于冠心病的治療,在支架植入后,如何預防再狹窄是保持支架作用長期穩定性的關鍵,雷帕霉素細胞內的作用靶點是雷帕霉素靶蛋白(mTOR),其通常情況下被Akt磷酸化。雷帕霉素可以抑制mTOR下游的活化,包括JNK活化以及誘導凋亡[6],從而抑制VSM C的增殖,達到防止再狹窄的目的。目前,雷帕霉素涂層支架已經應用于臨床治療并被認可,丁酸鈉作為人體內生理存在的成分,是否可以作為預防再狹窄的藥物?值得進一步研究。

[1]Kozarides T.Histone acetylases and dacetylases in cell proliferation[J].Curr Opin Genet Dev,1999,9:40.

[2]Ranganna K,Yousefipour Z,Yatsu FM,et al.Gene expression profile ofbutyrate-inhibited vascularsmooth muscle cell proliferation[J].M ol Cell Biochem,2003,254(1-2):21.

[3]Ranganna K,M athew OP,Yatsu FM,et al.Involvement of glutathione/glutathione S-transferase antioxidant system in butyrate-inhibited vascular smooth muscle cell proliferation[J].FEBS,2007,274(22):5962.

[4]Sassi Y,Lipskaia L,Vandecasteele G,et al.Multidrug resistance-associated protein 4 regulates cAM P-dependent signaling pathways and controls human and rat SMC proliferation[J].J Clin Invest,2008,118(8):2747.

[5]Owens GK,Kumar MS,Wamhoff BR.Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease[J].Physiol Rev,2004,84(3):767.

[6]Huang S,Shu L,Dilling MB,et al.Sustained activation of the JNK cascade and rapamycin-induced apoptosis are suppressed by p53/p21(Cip1)[J].Mol Cell,2003,11(6):1491.