西南地區(qū)鴨疫里默氏菌血清型調(diào)查和三價滅活油乳劑疫苗的研制

田 令 ，岳 華 ，2，湯 承 ，2

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省高等院校動物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

1 材料

1.1 菌株 2006年1月至2009年7月，從四川、重慶、云南規(guī)模化養(yǎng)鴨場中分離得到的261株鴨疫里默氏菌（RA），均為本室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 1日齡健康櫻桃谷鴨,購自成都某種禽公司；昆明系雄性小白鼠18～22g，購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 培養(yǎng)基和血清 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自杭州微生物試劑有限公司；LB培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室配制；新生小牛血清購自成都哈里生物公司；血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型RA參考菌株由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心李明義教授惠贈。10號白油購自廣州俏靈兒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 血清型鑒定 采用玻片凝集試驗(yàn)對261株RA分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。

2.2 RA菌液濃度的測定 將RA接種于含5%小牛血清的LB肉湯中，置于37℃下振蕩培養(yǎng)18h，用菌落平板計(jì)數(shù)法測定10倍系列稀釋菌液的CFU，同時用紫外分光計(jì)測定對應(yīng)濃度菌液的OD值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 疫苗株的篩選 挑選血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA分離菌株各5株，分別制備不同血清型的RA單價滅活油乳劑疫苗，疫苗中的抗原濃度為1.0×109CFU/mL。按下列程序免疫小鼠，每種疫苗免疫5只小鼠：首免，頸部和背部四點(diǎn)注射，每只0.2mL；分別間隔15d和10d后用相同劑量和方法進(jìn)行二免和三免；三免后第9 d對各組小鼠斷尾采血，分離血清，用玻片凝集試驗(yàn)檢測血清RA凝集價，選擇各血清型中凝集價最高的RA菌株為疫苗種子株。

2.4 RA三價滅活油乳劑疫苗的制備 分別將3個血清型RA種子株接種于含5%血清的LB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)18h，加入0.3%甲醛溶液后置于37℃振蕩培養(yǎng)箱里滅活18h，按文獻(xiàn)方法制備RA三價滅活油乳劑疫苗，疫苗中各型抗原含量均為1.6×109CFU/mL，同時進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。

2.5 安全性試驗(yàn) 將33只3日齡健康雛鴨隨機(jī)平均分成3組，每組11只。第1組注射RA三價滅活油乳劑疫苗1mL，第2組注射三價滅活油乳劑疫苗2mL，第3組注射1mL無抗原佐劑乳化物作為免疫空白對照。

2.6 免疫效力測定 將288只3日齡健康雛鴨平均分成2組，每組 144只。第1組為免疫組，經(jīng)頸部皮下接種0.5mL/只RA三價滅活油乳劑疫苗；第2組為空白對照組，經(jīng)頸部皮下接種相同劑量的無抗原佐劑乳化物。各組于免疫后第6 d、14 d、21 d、28 d分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA攻毒。每組每個血清型分別攻毒12只，2×108CFU/只，連續(xù)觀察7d，記錄發(fā)病死亡情況。對死亡鴨進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離，存活鴨于觀察結(jié)束時處死，同樣進(jìn)行病例剖檢和細(xì)菌分離，以未出現(xiàn)病變和RA分離陰性為免疫保護(hù)。

3 結(jié)果

3.1 RA分離株的血清型 對261株RA血清型的鑒定結(jié)果顯示，血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型RA分別占總分離株的39.85%、17.24%、11.11%、8.8%，未檢出血清Ⅲ型菌株，未定型菌株占23.2%。

3.2 疫苗種子株的篩選結(jié)果 根據(jù)免疫后小鼠血清平板凝集價分別篩選出血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 型RA疫苗的種子株各1株，菌株編號為SWUN0269、SWUN1065、SWUN1093。

3.3 疫苗質(zhì)檢結(jié)果 RA三價滅活油乳劑疫苗離心15min無分層現(xiàn)象，滴于冷水表面不分散，為油包水狀態(tài)，黏度試驗(yàn)顯示流速為6.4s，菌檢結(jié)果為陰性。

3.4 疫苗的安全性 2mL/只注射組的雛鴨僅在12h內(nèi)精神稍差，食欲有所下降，之后恢復(fù)正常；1mL/只注射組和1mL/只空白對照組的鴨只未見異常。

3.5 疫苗免疫效力 三價滅活油乳劑疫苗首免后各組鴨只的攻毒保護(hù)情況見表1。

表1 RA三價滅活油乳劑疫苗免疫后不同時間的攻毒保護(hù)結(jié)果

從表1可見，免疫后6 d攻毒，免疫組和空白對照組之間保護(hù)數(shù)無顯著差異，說明此時疫苗尚未產(chǎn)生有效免疫保護(hù)；至免疫后第14 d，免疫組的攻毒保護(hù)率顯著高于空白對照組，對3個血清型的攻毒保護(hù)率均在83.33%～100%，并持續(xù)至28 d未見下降。

4 討論

本研究結(jié)果顯示西南地區(qū)至少存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ4個不同的血清型，說明西南地區(qū)鴨群中鴨疫里默氏菌病的病原復(fù)雜多樣，血清Ⅰ、Ⅱ型為優(yōu)勢血清型，與國內(nèi)其他地區(qū)情況類似。值得注意的是，2003年四川、重慶、云南等省市的血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA菌株占總分離株的52.06%，而我們的研究結(jié)果顯示2006～2009年這些地區(qū)Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型分離株占總分離株的68.20%，分離率有顯著增高的趨勢，這也是本研究選擇研究三價滅活疫苗的重要依據(jù)。

此次我們的研究結(jié)果顯示，在3日齡免疫后14d分別用同型RA攻毒，其保護(hù)力均達(dá)到83.33%以上，有的血清型的保護(hù)率高達(dá)91.67%，與文獻(xiàn)比較有的血清型攻毒保護(hù)力稍低，這可能與攻毒濃度及不同血清型RA毒力差異和對雛鴨免疫的日齡有關(guān)。從后兩次攻毒保護(hù)試驗(yàn)來看，最高保護(hù)力也可達(dá)到100%，且持續(xù)至28d保護(hù)力未下降，說明該三價滅活油乳劑疫苗在對雛鴨進(jìn)行一次免疫后就具有很好的保護(hù)力，且持續(xù)期長，足以保護(hù)雛鴨至上市日齡。

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