舊院黑雞致病性大腸桿菌的分離與藥敏試驗

何 博

（四川省達州職業技術學院經濟管理系，四川 達州 635001）

2009年10月初，我校附近一小型養雞戶養殖的舊院黑雞發病，并有死亡。通過臨床癥狀，病理剖檢初步診斷為舊院黑雞大腸桿菌病。從現場采集了病料，通過病原分離、生化培養等試驗，最終確定病原體為禽致病性大腸桿菌。分離的大腸桿菌用臨床常用抗生素進行了藥敏試驗，根據藥敏結果合理選擇藥物，有效地控制了該雞場的病情。現報道如下：

1 材料

1.1 病料來源 無菌采集自發病養殖場患病死亡的舊院黑雞的肝臟和心血。

1.2 主要試劑及培養基 培養基：營養瓊脂平板、營養瓊脂斜面、麥康凱瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面等，所有培養基均按照文獻[1]自行配制；細菌生化鑒定管：腸桿菌科細菌生化常規微量鑒定管（11種×15支/盒），杭州天和微生物試劑有限公司生產；試劑：細菌生化微量試驗試劑盒（10mL×10種），杭州天和微生物試劑有限公司生產；革蘭氏染液、麥氏標準比濁管等自行準備。

1.3 藥敏紙片 氨芐西林、氨芐西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢噻吩、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素、環丙沙星、諾氟沙星、四環素等11種藥敏紙片由杭州天和微生物試劑有限公司生產；氟苯尼考藥敏紙片按文獻[2]自行制作。

1.4 主要試驗設備 恒溫培養箱、生物顯微鏡、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、分光光度計、pH計、電爐、冰箱等。

1.5 試驗動物 健康小白鼠10只，體重18～22g/只。

2 方法

2.1 細菌的分離培養 無菌采集病死雞的肝臟、心血，劃線接種于營養瓊脂平板上，37℃培養18～24h，然后挑取單個菌落接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養18～24h，再選取平板中單個典型菌落接種于營養瓊脂斜面上，37℃培養18～24h，4℃保存備用。

2.2 細菌的染色鏡檢 用滅菌接種環挑取營養瓊脂斜面上的菌落制成涂片，革蘭氏染色后鏡檢。

2.3 生化試驗 挑取營養瓊脂斜面上的菌落接種到三糖鐵培養基上，37℃培養18～24h，觀察細菌在培養基上的生長特征。參照生化鑒定管使用說明書，挑取營養瓊脂斜面上的單個菌落接種于腸桿菌科細菌生化常規微量鑒定管內，37℃培養，按規定時間對菌株的生化反應結果進行判斷。

2.4 動物試驗 取細菌的營養瓊脂斜面培養物，用滅菌生理鹽水無菌洗下制成細菌懸液，將菌懸液的濃度用生理鹽水調至0.5麥氏單位（細菌數約為1.5×108CFU/mL）待用。將10只小白鼠隨機平均分成2組，每組5只，第1組每只小白鼠腹腔注射菌懸液0.2mL；第2組腹腔注射無菌生理鹽水0.2mL作對照。隔離飼養，觀察小白鼠的發病死亡情況。小白鼠死亡后剖檢，將病變組織接種于麥康凱培養基上，挑取可疑菌落鏡檢、生化鑒定。

2.5 藥敏試驗 按“紙片法抗菌藥物敏感試驗標準”進行藥敏試驗。用一無菌棉拭子蘸取校正為0.5麥氏單位的菌懸液，在管壁旋轉擠壓幾次，去掉過多的菌液，均勻涂布于整個瓊脂平板表面。等平板上的菌液稍干后，將藥敏片依次均勻貼放到平板上。各紙片中心相距約24mm，紙片距平板邊緣約15mm，各紙片間距離相等。將平板倒置于37℃溫箱中培養16～18h，然后觀察結果。

3 結果

3.1 細菌的培養特性 經37℃培養18～24 h后，該病料菌株在營養培養基上生長良好，形成一種圓形凸突、光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明、中等大小的灰白色菌落；在麥康凱瓊脂培養基上形成直徑1～2mm左右、光滑濕潤的紅色菌落；在三糖鐵瓊脂斜面中，斜面變黃，管底變黃、產氣，無H2S產生。

3.2 染色鏡檢結果 細菌涂片經革蘭氏染色后鏡檢，可見：陰性小桿菌，兩端鈍圓，散在或成對存在。

3.3 生化試驗結果 分離菌株的生化試驗結果見表1。分離菌株的生化特性完全符合大腸桿菌的特征。綜合培養特征、鏡檢特征、生化試驗結果，可鑒定此分離菌株為大腸桿菌。

表1 分離菌株的生化試驗結果

3.4 動物試驗結果 小白鼠在細菌接種后24～48h內全部死亡。剖檢死亡小白鼠，發現肝臟腫脹出血，心外膜出血，從死亡小白鼠的肝臟和心血中，分離得到與原分離菌株一致的革蘭氏陰性桿菌。對照組無異常表現。這說明分離菌株為致病性大腸桿菌。

3.5 藥敏試驗結果 將分離的菌株與氨芐西林、環丙沙星等12種常用抗菌藥進行藥敏試驗，結果表明菌株對其中的3種敏感，3種中敏，6種耐藥。結果見表2。

表2 藥敏試驗判斷標準及結果

4 小結與討論

4.1 根據分離菌株的培養特性、染色特性、生化試驗及動物試驗結果，鑒定分離菌為致病性大腸桿菌。雞的大腸桿菌病是由大腸桿菌某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱，本病一年四季均可發生，各個品種和日齡的雞均可發病，但雛雞最易感，雛雞發病率可達30%～60%，病死率可達100%。

4.2 大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產生耐藥性的細菌，由于近年來抗菌藥物使用頻率和使用量的增加，導致大腸桿菌耐藥株和耐藥能力都不斷增加。本次藥敏試驗結果也表明，曾對大腸桿菌敏感的廣譜青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類抗菌藥隨著臨床的廣泛應用而產生了不同程度的耐藥。

根據藥敏試驗結果，選擇高敏藥物——氟苯尼考的可溶性粉劑對全場雞混飲（100mg/L）給藥，每天2次，每次2h，連續使用4d，同時加強對飼喂用具及雞舍環境的衛生消毒，可以有效地控制雞只死亡，使雞群逐步恢復健康。

4.3 大腸桿菌是一種普遍存在的腸道常在菌群，防治本病的關鍵是：加強飼養管理、消除各種應激因素，增強雞只的抵抗力；加強環境衛生管理，做好各個養殖環節的衛生消毒，控制大腸桿菌的大量繁殖。

4.4 為了有效防治大腸桿菌病，也為了減少畜產品中抗菌藥物的殘留，在臨床用藥時應注意：避免采用抗菌藥低劑量長期預防用藥，可選用無毒性、無殘留的微生態制劑或有效的大腸桿菌疫苗進行日常預防；為了增加治療的針對性，最好使用經藥敏試驗篩選的敏感性藥物進行治療，病愈后應及時停藥；加大開發有效的滅活酶抑制劑、外輸泵抑制劑、耐藥質粒消除劑、抗菌藥物增強劑等，和抗菌藥物聯合使用，提高藥物的敏感性，降低使用劑量；加強開發對大腸桿菌有抑制作用的中草藥制劑，發揮其低毒性、無殘留、不產生耐藥的優點。

[1]甘肅農業大學主編.獸醫微生物學試驗指導[M].北京：中國農業出版社，1991.

[2]周喜翠.簡易藥敏紙片的制作和應用 [J].北方牧業，2005，23：27.

[3]中華人民共和國衛生部.紙片法抗菌藥物敏感試驗標準[S].WS/T 125-1999.

[4]甘肅農業大學主編.獸醫微生物學[M].北京：中國農業出版社，1994：212-217.

[5]蔡寶祥.家畜傳染病學（第4版）[M].北京：中國農業出版社，2006：47.

[6]常維山，王應文，孫金華，等.我國部分地區雞源大腸桿菌耐藥性分析[J].山東畜牧獸醫，2009，30：44-46.

[7]史同瑞，周建麗，許臘梅，等.應用微生態制劑防治雞大腸桿菌病試驗[J].畜禽業，2008，（8）：36-37.