薄層色譜法測定山東觀賞牡丹中丹皮酚的含量

苗方 李琳 趙訓允 安 蕓

(菏澤醫學專科學校 山東 菏澤 274000;①山東省牡丹大藥房)

牡丹皮為毛莨科芍藥屬植物牡丹的干燥根。本品為《中國藥典》收載品種,性微寒、味苦。具有清熱涼血、活血化瘀之功效[1]。牡丹皮目前正作為一種傳統中藥被日益重視和廣泛使用。經藥理研究證明,具有催眠、抗炎、鎮痛、解痙等作用[2]。在日化方面,可將皮膚中沉積色素還原褐色,使皮膚增白,對色斑、肌肉痛具有較好治療和保健效果[3]。有文獻報道,用高效液相色譜法和差示分光光度法測定丹皮酚含量的報道[4]。本文用薄層色譜法結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津 Cs-900型雙波長薄層掃描儀(日本島津);定量毛細管(日本島津公司);薄層自動鋪板器(重慶南岸新力實驗電器廠);AK-12A型中藥粉碎機(天津市華航制藥機械有限公司);超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠);薄層層析用硅膠 G(青島海洋化工廠)。丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所)供含量測定用,化學試劑均為分析純;乙醇(天津科密歐化學試劑開發中心;分析純)。

1.2 牡丹皮的采集方法 采收季節多在秋分和寒露之間,地上枝葉變黃枯萎時采挖。將挖出的根用力輾轉,頂端使根皮一側破裂,皮心略脫離,一手捻住不裂口的一側,一手捏住木心,將木心順破裂口往下邊拉,邊分離邊剝出,除去木心后順手把根條捻直,并撮合裂縫口,曬干,即為商品“牡丹皮”。產地:樣品采集采自菏澤市牡丹種植基地,藥材均為分株移植 3年的牡丹。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備。取供試藥材樣品,粉碎成直徑不大于 2mm的碎塊,潤濕 120min。精密提取 5g,置索氏提取器中,用氯仿 60mL回流提取 10h,提取液減壓濃縮至小體積,用無水乙醇定容于 10mL容量瓶中,作為供試品溶液。

2.1.2 標準品溶液的制備。精密稱取丹皮酚對照品 5mg,用無水乙醇定容至 10mL,作為標準品溶液。

2.1.3 缺牡丹皮空白對照液的制備。按處方比例稱取除牡丹皮外的其它藥材,按樣品的制備工藝及樣品溶液的制備方法,制得缺牡丹皮空白對照溶液10mL。

2.2 薄層層析條件 稱取硅膠 G5g,用 0.3%CMC-Na液14mL在勻漿機中調和均勻后,用鋪板器均勻涂鋪于 20cm×20cm薄層板上,厚 0.3mm,自然干燥后在 110℃活化 1.5h,取出置干燥器內備用,將樣品與對照品溶液 5點于同一薄層板上,以環己烷 -氯仿 -無水乙醇(7:3:1)溶劑系統上展開 10cm,揮干溶劑,于紫外燈 257nm下定位在薄層掃描儀上測定。

2.3 薄層掃描測定條件 掃描方式為反波長反射法,鋸齒掃描:測定波 長 λs=274nm,參比波長 λR=365nm,掃描速度20mm/min反射鋸齒掃描;夾縫 1.25mm×1.25mm線性參數Sx=3。

3 結果

測得觀賞牡丹皮中丹皮酚含量為 1.46mg/g,加樣回收率為97.60%,變異系數為 1.15%。

3.1 空白干擾試驗 按含量測定條件,對點樣層析后的供品、丹皮酚及缺丹皮空白液的各斑點分別在 λs=274nm,λR=365nm進行掃描,劃出吸收曲線。結果表明:缺牡丹皮空白液在與丹皮酚對應位置上無明顯吸收峰,基本上為平線,而標準品、供試品在相應位置上有明顯的吸收峰,這表明本測定無明顯干擾。

3.2 線標關系考察(標準曲線) 精密吸取標準品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL點于同一硅膠 G薄層板上,將選定的色譜條件,展開,取出晾干,置紫外燈下檢識定位,掃描測定,以點樣量(μg)為橫坐標,峰面積分值為縱坐標,繪制標準曲線。結果表明:丹皮酚在 1～1.5μg范圍內,點樣量與峰面積積分分值呈良好線性關系,所得數據進行處理得回歸方程 Y=32316x+6080,相關系數r=0.9987表明在其范圍呈現良好的線性關系,并通過原點。

3.3 穩定性試驗 精密吸收丹皮酚對照品和供試品溶液于同一塊薄層板上展開,揮于展開劑,立即掃描測定斑點峰面積值,每隔 0.5h掃描 1次連續 3h,結果表明:對照品和供試品斑點在測定時間 100min內斑點穩定,峰面積積分值基本不變。

3.4 精密度試驗

3.4.1 同板精密度試驗。準確吸收標準品溶液 4μL,供試品溶液 4μL,在同一薄層板上點 5個相同量的點,依法測定各斑點的斑面積積分值并計算精密度,結果見表 1。

表1 同板精密度實驗結果

3.4.2 異板間精密度試驗。準確吸取標準品溶液 4μL,供試品溶液 4μL,分別點于 5塊薄層板上,每板點 5個相同量的點,依法測定并計算各板樣品中丹皮酚的含量。結果見表 2。

表2 異板精密度試驗結果

3.5 重現性試驗 取同一批樣品約5g,精密稱定,共稱取6份,依法測定各樣品中丹皮酚的含量,結果6次測得平均值為1.165mg/g,變異系數 RSD=1.76%,表明重復性良好。

3.6 加樣回收率試驗 精密稱取牡丹皮約 5g,分別精密加入丹皮酚對照品約 3mg,然后按照供試品溶液的制備方法,回收實驗液,依法測定各實驗液中丹皮酚含量,并計算回收率,結果 5次測定的平均回收率為 97.60%,變異系數為 1.15%。結果見表3。

表3 加樣回收率實驗結果

3.7 樣品含量測定 精密吸取 3批供試品溶液各 4μL及丹皮酚標準品溶液 2、4μL點于同一薄層板上,依法展開,掃描,按外標兩點法計算樣品中丹皮酚含量,結果見表 4。

表4 含量測定結果

4 討論

丹皮酚為主要有效成分且已成為衡量丹皮質量的法定標準之一。《中國藥典》規定秋季采取丹皮,當地農戶一般在立秋后開始采挖。至霜降前采取完畢,在春夏兩季開始正是牡丹生長發育高峰期,光合作用旺盛,對丹皮的產量影響甚大,當地農戶在采取牡丹根后,用竹片或其它工具刮去根的表皮(即木全皮層)抽去木心,曬干即為刮丹皮,在國內市場銷售,若只抽去木心,不刮表皮,直接曬干,即為原丹皮主要供外貿出口[5]。

對牡丹皮干燥藥材設計正交試驗考察提取條件,考察項目為溶劑(水、乙醇、丙酮)粉碎度(切片、粗粉、中粉)提取方式(回流、超聲、索氏提取)提取時間(8、10、12h)。結果表明,最佳提取時間為 95%乙醇索氏提取 10h。測量觀賞牡丹皮中丹皮酚的含量,方法簡便,重現性好,靈敏度高,適用于測定牡丹皮及其制劑中丹皮酚的含量。自唐代以來,牡丹廣泛種植,山東省是我國觀賞和藥用牡丹的主產區之一。曹州菏澤栽培面積近 15萬畝,觀賞品種近千個,年產丹皮近百噸[6]。牡丹皮藥理學研究表明[7],丹皮酚具有重要的藥理作用。因此,通常以丹皮酚含量作為質量控制的主要指標[8]。張氏等[9]研究,丹皮酚含量和牡丹皮中另一有效成分芍藥苷呈明顯正相關。所以本實驗在其它檢測指標符合《中華人民共和國藥典》規定時,以丹皮酚含量高低判斷藥材質量。為菏澤牡丹皮進入臨床提供參考。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中國藥典 I部[S].北京:化學工業出版社,2000.137

[2]張 旃.丹皮酚的藥理作用及機制[J].中醫藥信息,2006,23(2):21

[3]戴 敏,劉青云,顧承剛,等.丹皮酚對脂質過氧化反應及低密度脂蛋白氧化修飾的抑制作用[J].中國中藥雜志,2000,25(10):625

[4]孫言才,沈玉先,孫國平,等.反相高效液相色譜法測定原料藥及注射液中丹皮酚的含量[J].中國藥理學通訊,2003,19(5):593

[5]安徽經濟植物志增修編寫辦公室.安徽經濟植物志(上冊)[M].合肥:安徽科學技術出版社,1990.260-261

[6]劉 超,陳光亮,趙幟平,等.丹皮多糖對正常及高血糖小鼠的降血糖作用[J].安徽中醫學院學報,1998,17(6):45

[7]莊明蕊,林 曉,崔麗華,等.牡丹皮質量評價分析[J].食品與藥品,2006,8(9):56

[8]龍全江,徐雪蓮,卞艷紅.市售丹皮酚飲片質量分析[J].時珍國醫國藥,2000,11(3):197

[9]張留記,屠萬倩,屈凌波,等.不同產地牡丹皮中丹皮酚和芍藥苷含量的 HPLC法測定[J].信陽師范學院學報,2007,20(2):223