APRIL在非小細胞肺癌中的表達研究①

孫寶蘭 朱 俐 王 行 倪紅兵 王惠民 (南通大學附屬醫院醫學檢驗中心,南通 226001)

肺癌高發病率、高死亡率,是嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤之一[1],其中非小細胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌的75%左右[2],在包括肺癌在內的各種腫瘤的發生發展過程中,相對于基因突變而言基因表達異常更為普遍,研究在NSCLC中異常表達的腫瘤相關基因,評價其在肺癌發生發展中的作用是有效預防和診斷NSCLC的前提。

增殖誘導配體(A proliferation-inducing ligand,APRIL)屬于腫瘤壞死因子超家族,大量研究表明,APRIL與腫瘤生長調節關系密切,在體內、外均能刺激腫瘤細胞生長,在多種腫瘤細胞株和腫瘤組織如結腸癌、腮腺癌及淋巴組織中都有高表達[3,4]。本文擬采用RTQ-PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTQ-PCR)、 Western blot和免疫組化技術(IHC)檢測APRIL在NSCLC組織中的表達情況,探討APRIL在肺癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 NSCLC新鮮組織標本取自2006年8月至2008年5月南通大學附屬醫院胸外科NSCLC手術病例68例,均經病理學檢查確診,所有患者術前未行化療及放療,其中男44例,女24例,年齡35～72歲,平均62.6歲。按WHO“肺腫瘤組織學分型”(2000)標準分類,組織病理分型為鱗癌36例,腺癌32例。全部標本于手術時收集,分裝后立即放入-70℃低溫冰箱凍存。肺癌組織取自原發癌灶,遠端正常肺組織取自距癌灶邊緣7厘米以上的部位,并經病理學檢查未見癌細胞。

NSCLC石蠟標本取自南通大學附屬醫院病理科2007年1月至2008年3月間的NSCLC 50例,入選標準:(1)術前未行放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療;(2)石蠟標本完好,臨床原始資料完整。其中男性31例,女性19例,平均年齡61.5歲。每例均重新復習閱片。組織病理分型為鱗癌26例,腺癌24例。高分化 6例,中分化26例,低分化18例。TNM分期:Ⅰ期19例,Ⅱ期24例,Ⅲ期5例,Ⅳ期2例。伴肺門和/或縱隔淋巴結轉移者33例。同時取遠端正常組織10例作為對照。所有標本均經10%福爾馬林固定,常規脫水后石蠟包埋,病理診斷無異議。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時熒光定量PCR(RTQ-PCR)檢測APRIL mRNA表達 根據APRIL注冊號(AF046888)和內參β2微球蛋白(β2microgluobulin,β2M)(注冊號 NM 004048),采用Primer Premier 5.0設計相應引物,引物序列如下:APRIL上游引物:5′-ACT CTC AGT TGC CCT CTG GTT G-3′(819 nt～840 nt),APRIL 下游引物 :5′-GGA ACT CTG CTC CGGGAGACT C-3′(984nt～1005 nt),擴增 片段長度 187 bp;β2M 上 游引物:5′-CTA TCC AGC GTA CTC CAA-3′(119 nt～ 136 nt),β2M下游引物:5′-GCA GGC ATA CTC ATC TTT T-3′(342 nt～360 nt),擴增片段長度242 bp,均由上海生物工程公司合成。取100 mg組織加1 ml Trizol(Invitrogen),按說明書操作提取細胞總RNA,核酸蛋白分析儀(HITACHI公司)檢測RNA質量和濃度;取總RNA 3.0 μ g,以Oligo(DT)18為引物,按試劑盒說明書逆轉錄為 cDNA,分裝后-20℃保存。將 2 μ l cDNA模板加入18 μ l PCR反應液(含 1×PCR buffer,4.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,APRIL或 β2M 上 、下游引物各0.15 μ mol/L,20×SYBR GreenⅠ0.3 μ l,Taq DNA聚合酶1.5 U。混勻后加入Roche專用毛細管中,并設空白對照、以空載質粒作模板的陰性對照和相應的6個質粒標準品(濃度分別為106、105、104、103、102、10 copies/μ l)。各反應管于 Roche 熒光定量檢測儀(Lightcycler)進行PCR擴增:94℃預變性3分鐘;94℃5秒,62℃35秒,共40個循環。根據各自標準品建立的標準曲線,由軟件自動計算待測樣本中APRIL或β2M準確含量,以所測APRIL mRNA和β2M mRNA含量的比值作為評價APRIL表達水平的指標。

1.2.2 Western blot檢測APRIL蛋白表達 稱取約100 mg組織標本,用剪刀剪碎,加入1 ml含PMSF的裂解液(碧云天)混勻,于冰浴中用勻漿器充分勻漿,低溫(4℃)12 000 r/min離心15分鐘。吸取上清液與5×樣品緩沖液混合,100℃變性,離心,加入樣品孔中,蛋白上樣量為50 μ g。電泳(80 V,20分鐘;100 V,90分鐘),凝膠(300 mA,130分鐘)轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜用1×TBS-T配制的5%的脫脂奶粉封閉,37℃震蕩1小時,洗膜5 min×3次,加入1∶1 000濃縮型兔抗人APRIL多克隆抗體(美國,芝加哥),4℃過夜,洗膜5分鐘×3次,加入二抗(1∶2 500)37℃孵育1小時,洗膜5分鐘×3次,ECL試劑顯影。以β-actin作為內參。

1.2.3 免疫組織化學法進一步研究APRIL蛋白表達和定位 濃縮型兔抗人APRIL多克隆抗體(美國 ,芝加哥),使用濃度 2 μ g/ml。即用型SP 法免疫組化檢測試劑盒(美國GBI公司),DAB顯色試劑盒(北京中山生物有限公司)。將入選的所有組織蠟塊每一個均連續切片2～3張、切片厚度5 μ m,其中 1張行HE染色,其余采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶連接(SP)免疫組化方法檢測,用PBS代替一抗作陰性對照,檢測程序嚴格按產品說明書進行。光學顯微鏡下以細胞漿和/或細胞膜被染成淡黃至棕黃色者為陽性細胞,評分根據Allred計分標準[5],按照染色的陽性細胞數和染色強度評分。陽性細胞數分為6個級別:0.無細胞染色;1.＜1%的細胞染色;2.1%～10%的細胞染色;3.11%～33%的細胞染色;4.34%～66%的細胞染色;5.＞67%的細胞染色。細胞染色強度分為4個級別:0.陰性(無染色);1.弱陽性(淡黃色);2.陽性(黃色);3.強陽性(棕黃色)。隨機選擇有代表性的10個高倍鏡視野,每個視野記數100個腫瘤細胞,以二者之和得分將APRIL免疫反應性分為3個級別:APRIL陰性(0分),APRIL陽性(1～6分),APRIL強陽性(7～8分)。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.5統計軟件,對計量資料采用t檢驗,并分別計算均數、標準差和變異系數,所得結果表示為±s;對計數資料采用Pear-son χ2相關分析,P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR(RTQ-PCR)檢測APRIL mRNA表達結果 68例NSCLC癌組織和遠端正常組織APRIL mRNA含量分別為0.72±0.06和 0.10±0.04(±s),統計學分析 P ＜0.05。其中36例鱗癌癌組織和其遠端正常組織APRIL mRNA分別為0.74±0.06和0.10±0.03;32例腺癌癌組織和其遠端正常組織APRIL mRNA分別為0.70±0.05和0.11±0.04,統計學分析均P＜0.05。鱗癌與腺癌癌組織APRIL mRNA水平統計學分析無顯著性差異(0.74±0.06 vs.0.70±0.05,P ＞0.05)(表1,圖1)。

2.2 Western blot檢測APRIL蛋白表達結果 在68對NSCLC癌組織及配對遠端正常組織標本中隨機選取25對標本進行檢測,結果顯示APRIL蛋白在癌組織標本中有陽性條帶,而在遠端正常組織無陽性條帶出現(圖2A)?；叶葤呙杞Y果顯示APRIL蛋白在NSCLC癌組織表達為0.94±0.12(±s),遠端正常組織為0.00,統計學分析癌組織和遠端正常組織APRIL蛋白表達差異明顯(P＜0.001)(圖2B)。

2.3 免疫組織化學檢測APRIL蛋白結果

2.3.1 APRIL蛋白在NSCLC中的定位和表達

APRIL陽性反應物質呈棕黃色且多位于陽性細胞胞漿/膜上,在50例NSCLC手術標本切片中,APRIL蛋白在46例肺癌組織中呈陽性表達(46/50,92%)(圖3A、B),其中,16例(16/50,32%)APRIL強陽性,30例(30/50,60%)APRIL陽性,4例(4/50,8%)陰性表達;10例遠端正常組織中1例(1/10,10%)APRIL表達陽性,9例(9/10,90%)APRIL陰性(圖3C),與癌組織相比,統計學分析P＜0.001。

2.3.2 APRIL蛋白表達與NSCLC臨床病理關系

APRIL蛋白表達分別與患者臨床病理資料:性別、年齡、淋巴結轉移、組織學分型、腫瘤病理分級、TNM分期等進行分析。結果表明,APRIL蛋白表達與淋巴結轉移(P=0.014)、腫瘤病理分級(P=0.000)和TNM分期(P=0.006)明顯相關,與性別、年齡、組織學分型無關(P均＞0.05)。見表2。

表1 非小細胞肺癌中APRIL mRNA表達Tab.1 The expression levels of APRIL mRNA in NSCLC

圖1 非小細胞肺癌中APRIL mRNA表達Fig.1 APRIL mRNA expression in NSCLC

圖2 非小細胞肺癌中APRIL蛋白表達Fig.2 Expression of APRIL protein in NSCLC

圖3 非小細胞肺癌組織中APRIL蛋白定位和表達(SP×200)Fig.3 APRIL protein location and expression in NSCLCby immunohistochemistry analysis(SP×200)Note:A.Squamous cell carcinoma;B.Adeocarcinoma;C.Normal tissue.

表2 APRIL蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系Tab.2 Correlation of APRIL expression in NSCLC to the clinical and pathological parameters

3 討論

腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超家族可誘導多種生物學效應,如細胞的增殖、分化和凋亡等,在機體的防御、炎癥反應及免疫調節等過程中起重要作用[6]。增殖誘導配體(A proliferation-inducing ligand,APRIL)是TNF超家族的一員[3],它有多種生物學作用,如刺激腫瘤細胞的生長[3,7],調節腫瘤細胞凋亡[8],活化核因子NF-kB等[9],并且和體液免疫的調節也密切相關[7,10]。

本研究中,我們首先采用熒光定量PCR技術分析了APRIL mRNA在NSCLC癌組織及其遠端正常組織中的表達水平,發現NSCLC癌組織中APRIL的水平顯著高于遠端正常組織(P＜0.05), Western blot和免疫組化技術研究APRIL的蛋白表達得到類似的結果: Western blot顯示APRIL在NSCLC的癌組織表達顯著高于遠端正常組織(P＜0.001),免疫組化結果表明APRIL在NSCLC惡性腫瘤組織中的陽性表達率(92%)顯著高于癌旁正常組織(10%)。這些結果都提示APRIL在NSCLC患者的癌組織中高水平表達,與施健等[11]報道APRIL mRNA在肺癌組織中高表達結果相一致。在 Western blot分析時我們發現,在遠端正常組中未檢測到APRIL蛋白表達,而同一正常組織標本用RTQ-PCR技術卻能檢測出APRIL mRNA有低水平表達,究其原因可能與RTQPCR檢測mRNA有更高的靈敏度有關。

與TNF家族內的其他成員不同,APRIL蛋白首先在高爾基體內加工修飾,經furin蛋白酶切割裂解后,部分可與 TWEAK結合形成APRIL的跨膜形式[12],這一理論成果我們在免疫組化結果中所觀察到的APRIL蛋白主要分布于陽性細胞胞漿/胞膜上得到證實。在分析APRIL蛋白表達與患者臨床病理資料的關系中,我們發現APRIL表達與肺腫瘤的淋巴結轉移和嚴重程度呈正相關,TNM分期中APRIL陽性程度雖在Ⅰ、Ⅱ期表達無差異,但都顯著低于Ⅲ-Ⅳ期;本課題組用RNA干擾技術敲低APRIL在結腸癌細胞株SW480中的表達時也發現APRIL與腫瘤的轉移和侵襲有關[13];同時Okano等[14]在研究APRIL對人肝細胞癌的作用時也發現APRIL能促進肝細胞增殖與侵襲,這些結果均說明APRIL在腫瘤的發生發展中發揮著重要作用。APRIL在腫瘤中的作用主要通過與其靶細胞表面的兩個受體——穿膜蛋白活化物(TACI)和B細胞成熟抗原(BCMA)結合發揮活性[7],但有研究發現APRIL在肺癌組織中可能是與其第三個特異性受體——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycans,HSPG)結合啟動下游信號傳導通路促進腫瘤細胞的生長分化[15],至于在非小細胞肺癌中具體是哪一種信號傳導通路發揮作用,本研究將在下一步的工作中進行。

綜上所述,APRIL在NSCLC中高表達,而且與NSCLC分化轉移有著密切關系,提示APRIL可能參與腫瘤發生、演進的過程,但是否可以作為NSCLC的一種預后因子,尚需進一步深入研究。

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