毒熱平注射液對流感病毒感染的巨噬細胞分泌NO的影響①

張艷麗 王寧萍 顧立剛 李澎濤 (寧夏醫科大學病原生物學與免疫學系,銀川 750004)

甲型流感病毒(Influenza A virus)是一種引起最為常見和高傳染性人類疾病的病原體,分布于世界各地,在人類和動物中具高致病率和死亡率,尤其是甲型H1N1流感,引起全世界的高度關注[1]。單核吞噬細胞是固有免疫的重要組成部分,在流感病毒感染的過程中,單核/巨噬細胞活化產生眾多種類的細胞因子,它們以網絡形式在調節機體的免疫應答和炎癥反應中起著重要作用。其中有些細胞因子可刺激內皮細胞和白細胞釋放一氧化氮(NO)、氧自由基等炎性介質,導致組織損傷。有研究表明,NO對免疫系統有雙重作用,低水平的NO可參與免疫應答的信息傳遞,而高水平NO則導致細胞毒作用,介導免疫損傷[2]。毒熱平注射液是根據中醫“毒損肺絡”的病機理論[3],結合現代醫學對下呼吸道感染性疾病的認識研制而成,有清熱解毒、涼血通絡的功效[4-6]。前期實驗研究表明,毒熱平注射液對小鼠流感病毒性肺炎有抑制作用;可明顯降低流感病毒感染小鼠的死亡率[7,8]。本實驗選用流感病毒亞甲型鼠肺適應株FM1(H1N1)感染小鼠巨噬細胞株Ana-1,旨在觀察毒熱平對流感病毒感染巨噬細胞NF-κ B活性和分泌NO的影響,為該藥的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 流感病毒亞甲型鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1),由中國中醫藥研究院中醫所提供,本實驗室-76℃保存備用。于九日齡雞胚尿囊腔連續傳代兩次后,測血凝滴度為1∶512。

1.1.2 細胞 小鼠腹腔巨噬細胞株Ana-1購自南京凱基生物科技發展有限公司,由本室傳代后使用。

1.1.3 藥物 毒熱平注射液(DRP),由黃芩、梔子、燈盞花和豬膽粉四味藥物制成的中藥復方注射劑,棕色液體,含生藥17.4 g/L,由廣東康美藥業有限公司開發提供(該藥目前尚在研發中)。

1.1.4 試劑 RPMI1640培養基,Gbico公司產品;新生牛血清購自民海生物公司;生長液:含10%新生牛血清的1640培養液;維持液:不含血清而含2 μ g/ml胰蛋白酶的 RPMI1640培養液;消化液:含0.5%胰蛋白酶和0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA);引物及相關試劑由賽百盛生物公司合成提供;RT逆轉錄試劑盒購于Fermentas公司;SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自美國應用生物公司;一抗:P65(sc-372),Santa cruz產品;二抗(抗兔)(ZB-2301)購自北京中山生物技術有限公司;Griess試劑:A液為0.1%萘替乙二胺;B液為5%的磷酸加1%的磺胺,避光4℃保存備用。使用時,A液和B液1∶1混勻即可。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬細胞株Ana-1的培養 復蘇小鼠腹腔巨噬細胞Ana-1,將細胞混懸于生長液中,37℃5%CO2培養箱培養,次日換液,3天后傳代1次,取生長狀態良好的Ana-1細胞,消化液作用5分鐘后,棄去消化液,加入適量生長液,吹打細胞,計數并調細胞濃度為3×106ml-1,移入24孔板,每孔加細胞懸液1 ml,貼壁培養4小時后棄去未貼壁的細胞。

1.2.2 病毒感染性測定(TCID50的測定) 用無血清RPMI1640培養液對流感病毒FM1行連續10倍遞次稀釋,將各稀釋度的病毒接種于3×106ml-1的Ana-1細胞中,每個稀釋度平行做6個復孔,同時設正常細胞對照。37℃吸附2小時后吸棄病毒液換用維持液繼續培養,每日在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應,并記錄病變程度和孔數,以細胞對照無明顯退變,病毒感染細胞病變率達50%及以上的細胞孔為病變孔,細胞病變率小于50%的為非病變孔,按Reed-Muench法計算病毒的TCID50(Median tissue culture infective dosage)。流感病毒FM1的 TCID50=10-4.3。

1.2.3 藥物細胞毒性實驗(MTT比色法) 待Ana-1細胞生長至對數生長期時,消化細胞,用生長液調整細胞至所需濃度,將該細胞液加入96孔細胞培養板中 ,100 μ l/孔 ,于 37℃、5%CO2培養箱中培養至致密細胞單層。用維持液將DRP稀釋為不同濃度,加入細胞培養板中,100 μ l/孔,每個藥物稀釋濃度平行做3個復孔,同時設正常細胞對照。于37℃、5%CO2培養箱中培養72小時后,用MTT(終濃度為0.5 mg/ml)比色法檢測藥物對Ana-1細胞的毒性,按Reed-Muench法計算藥物最大無毒濃度(TC0)和半數中毒濃度(TC50)。

1.2.4 DRP作用于病毒感染的巨噬細胞 用維持液稀釋100TCID50的流感病毒FM1株,0.5 ml/孔于37℃吸附單層Ana-1細胞1.5小時后,吸棄病毒液用溫浴的PBS清洗細胞2遍后,換用6個濃度的含藥維持液作為實驗藥物組,分別為60 μ g/ml組、30 μ g/ml 組 、10 μ g/ml 組 、1 μ g/ml 組 、0.1 μ g/ml 組和0.01 μ g/ml組,同時設有正常細胞對照組和病毒對照組,每濃度3個復孔。37℃、5%CO2培養箱培養,分別作用6、12、24和36小時。

1.2.5 NO的測定 分別吸取孵育4個時間段的各孔細胞上清 100 μ l,加入 Griess試劑,100 μ l/孔 ,室溫顯色10分鐘,酶標儀530 nm下測定各孔的A值。同時,將1 μ g/ml組作用24小時的細胞培養板用封口膜封閉,迅速放入-76℃保存以備提取核蛋白。

1.2.6 測定NF-κ B p65的表達 嚴格按試劑盒說明步驟提取巨噬細胞RNA和核蛋白。按購自Fermentas公司的RT逆轉錄試劑盒操作說明進行逆轉錄 :20 μ l體系中含有 5 ×M-MLV buffer 4 μ l,dNTP 10 mmol,Rnasein 20 U,M-MLV 100 U,Oligo dT 20 pmol,RNA 1 μ g。逆轉錄反應條件為:20℃5分鐘,42℃60分鐘,70℃5分鐘,冰浴冷卻后置-20℃保存。在ABI的PRISM 7700型熒光定量PCR儀上進行Real Time PCR反應,測定NF-κ B p65 mRNA 的表達(引物序列見表1):20 μ l PCR反應體系中含 2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μ l,cDNA 2 μ l,上游引物 1 μ l,下游引物 1 μ l。PCR 擴增條件為 95℃3 分鐘變性,94℃30秒,60℃30秒,72℃45秒;共 40個循環,最后是72℃7分鐘延伸,擴增完畢后對產物行凝膠電泳分析。

表1 NF-κ B p65的引物序列Tab.1 Primer for NF-κ B p65

采用 Western blot方法檢測DRP 1 μ g/ml作用于流感病毒感染巨噬細胞24小時后NF-κ B p65蛋白表達水平,內參為β-actin。Image Tool凝膠分析軟件分析 Western blot電泳圖像,用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.3 統計學方法 實驗數據采用SPSS11.0軟件進行統計分析。結果以x—±s表示,采用t檢驗,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 細胞狀態的觀察 于鏡下逐日觀察Ana-1細胞,正常細胞對照組細胞形態正常、排列嚴密、貼壁緊;病毒對照組細胞24小時后開始出現圓縮,失去原有形態,且隨培養時間延長細胞開始從瓶壁脫落,漂浮在培養液中。

2.2 藥物對細胞的毒性測定 檢測藥物的最大無毒濃度(TC0)為1.09 g/L,半數毒性濃度(TC50)為2.73 g/L。

2.3 藥物對病毒感染巨噬細胞分泌NO的影響

DRP 采用六個濃度:60、30、10、1、0.1 和 0.01 μ g/ml。分別作用于病毒感染的Ana-1細胞6、12、24和36小時。觀察其對病毒感染巨噬細胞釋放NO水平的影響,結果如表2。

結果顯示,不同濃度的DRP作用于病毒感染的巨噬細胞四個時間段,其中除0.1 μ g/ml濃度組作用6小時無抑制病毒感染巨噬細胞釋放NO的作用,其他各濃度組均有抑制作用,與病毒對照組有極顯著的差異。

2.4 NF-κ B p65 mRNA擴增產物凝膠電泳 行Real Time PCR反應前,首先要設計引物,因為引物序列合適與否對于實驗有決定性的作用。反應完畢后對熒光定量PCR擴增產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下掃描分析結果(見圖1)。

電泳結果表明,擴增的基因片段長度包括內參β-actin均符合設計要求,結果與熒光定量PCR一致,說明整個反應體系準確、可靠。

2.5 DRP對Ana-1細胞表達NF-κ B p65 mRNA 的影響 根據標準曲線求出待測樣本目的基因mRNA的相對拷貝數,與相對應的β-actin的相對拷貝數比較,求出其mRNA表達水平。結果如表3所示。

表2 不同作用時間巨噬細胞上清NO含量的測定(A值,±s,n=6)Tab.2 Assay of NO secred by macrophages on different time treated with DRP(A value,±s,n=6)

表2 不同作用時間巨噬細胞上清NO含量的測定(A值,±s,n=6)Tab.2 Assay of NO secred by macrophages on different time treated with DRP(A value,±s,n=6)

Note:DRP groups compared with virus control group,1)P＜0.05,2)P＜0.01;Virus control group compared with cell control,1)P＜0.05,3)P＜0.001.

Group 6 h 12 h 24 h 36 h Cell control 0.021±0.001 0.038±0.008 0.036±0.004 0.061±0.019 Virus control 0.031±0.0043) 0.075±0.0613) 0.084±0.0063) 0.107±0.0121)60 μ g/ml 0.024±0.0042) 0.042±0.0131) 0.046±0.0092) 0.059±0.0012)30 μ g/ml 0.025±0.0052) 0.048±0.0052) 0.054±0.0121) 0.062±0.01052)10 μ g/ml 0.026±0.0042) 0.057±0.0081) 0.056±0.0121) 0.064±0.0092)1μ g/ml 0.030±0.0041) 0.059±0.0041) 0.060±0.0071) 0.067±0.0161)0.1 μ g/ml 0.034±0.007 0.069±0.011 0.064±0.0081) 0.074±0.0061)0.01 μ g/ml 0.042±0.015 0.098±0.031 0.072±0.0041) 0.084±0.0671)

圖1 mRNA擴增產物凝膠電泳Fig.1 Electrophoretogram of mRNA amplification

表3 DRP作用24小時后NF-κ B p65 mRNA的表達(±s)Tab.3 The effect of DRP on expression of NF-κ B p65 mRNA treated for 24 h( ±s)

表3 DRP作用24小時后NF-κ B p65 mRNA的表達(±s)Tab.3 The effect of DRP on expression of NF-κ B p65 mRNA treated for 24 h( ±s)

Note:Cell control group compared with virus control group,1)P＜0.001;DRP group compared with virus control group,2)P＜0.01.

Groups NF-κ B p65 Cell control 0.072±0.003 Virus control 0.687±0.0051)DRP 1 μ g/ml 0.227±0.0072)

表4 DRP作用24小時后p65/β-actin灰度值的變化(±s,n=6)Tab.4 The change of p65/β-actin gray value on 24 h treated with DRP(±s,n=6)

表4 DRP作用24小時后p65/β-actin灰度值的變化(±s,n=6)Tab.4 The change of p65/β-actin gray value on 24 h treated with DRP(±s,n=6)

Note:Cell control group compared with virus control group,1)P＜0.001;DRP group compared with virus control group,2)P＜0.001.

Groups 24 h Cell control 0.070±0.004 Virus control 0.650±0.0031)DRP 1 μ g/ml 0.250 ±0.0022)

結果表明,DRP能明顯下調NF-κ B p65mRNA表達的水平。

2.6 DRP對Ana-1細胞表達NF-κ B p65的影響 用 Western blot的方法檢測DRP 1 μ g/ml作用于流感病毒感染巨噬細胞24小時后的巨噬細胞NF-κ B p65的表達,同時用細胞骨架蛋白β-actin為內參,檢測樣品的內參量和p65蛋白量(表4)。

DRP作用24小時的p65/β-actin變化顯示,病毒對照組與細胞對照組NF-κ B p65蛋白表達量差異極顯著,DRP 1 μ g/ml組能明顯下調流感病毒感染的巨噬細胞NF-κ B p65蛋白的表達。

3 討論

在流感病毒感染的過程中,單核/巨噬細胞活化產生眾多種類的細胞因子,它們以網絡形式在調節機體的免疫應答和炎癥反應中起著重要作用。故本研究建立病毒感染的小鼠腹腔巨噬細胞模型來觀察DRP抗流感病毒的部分機制。

在哺乳動物細胞內有三種NO合成酶。其中,誘導性NO合成酶(iNOS)表達不依賴細胞內鈣離子濃度變化,且通常情況下不表達。但在細菌、病毒或內毒素 、TNF-α、IFN-γ、IL-1 等細胞因子刺激下,巨噬細胞、中性粒細胞、血管平滑肌及肝細胞等組織細胞內iNOS表達顯著增高,釋放大量NO,激發幾種不利的細胞反應而導致炎癥和休克[9,10];且iNOS誘導的NO產生的水平能反映機體的炎癥程度。在本實驗中,病毒感染的巨噬細胞產生NO水平顯著高于未被病毒感染的細胞,隨著培養時間的延長,NO釋放水平逐漸增高;不同濃度的DRP作用不同的時間,均能下調NO水平。NF-κ B介導NO對炎癥反應的調節過程。靜息狀態下,NF-κ B與NF-κ B抑制蛋白Iκ Bα結合,存在于細胞漿中。許多的外源性刺激如內毒素、多種細胞因子等均可使 Iκ Bα磷酸化,從而與NF-κ B 分離 ,使 NF-κ B 活化,移位至細胞核內,繼之與炎癥細胞因子基因的啟動子區結合,啟動基因轉錄,這些基因產物就可啟動和調節固有免疫,并誘導適應性免疫的產生。參與調節多種促炎細胞因子的合成,在早期發揮抗病毒作用。但是,炎癥因子和趨化因子的過度表達還會損傷組織,加重流感病毒所致的病理改變,如肺損傷,促進病情的進一步發展。本實驗用 Western blot方法測定1 μ g/ml DRP作用于流感病毒感染的巨噬細胞24小時,觀察其核因子NF-κ B p65蛋白的變化。結果表明DRP確能顯著下調病毒活化巨噬細胞核因子NF-κ B p65蛋白的表達,與該藥下調核因子NF-κ B p65 mRNA表達水平相一致。本研究證實,DRP能下調病毒活化巨噬細胞核因子NF-κ B p65的表達;調節病毒感染后巨噬細胞釋放NO在適量水平,抑制巨噬細胞炎癥細胞因子的釋放,限制炎癥介質對組織器官的損害,減緩炎性病變,控制病情的發展。究其如何影響NF-κ B信號轉導通路的活性,本實驗室將在后面的研究中進一步探討。

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