中國經采供血HIV感染長期不進展者CD4+T淋巴細胞趨化因子受體表達研究①

張子寧 尚 紅 姜擁軍 王亞男 張 韓曉旭 施萬英 李革飛 金 鑫

(中國醫科大學附屬第一醫院衛生部艾滋病免疫學重點實驗室,沈陽 110001)

目前,艾滋病仍無治愈的方法,疫苗的研發多以失敗告終,原因之一在于未能闡明病毒與人體免疫系統相互作用的復雜性。HIV感染后,90%的HIV感染者經8～10年進入艾滋病期,疾病呈現典型進展狀態。但5%～10%的HIV感染者,雖然感染時間已超過10年,未經高效抗逆轉錄病毒(Highly active anti-retroviral therapy,HAART)治療,CD4+T細胞數卻仍為正常,免疫功能接近于正常狀態,被稱為長期不進展者(Long-term non progressors,LTNP)[1]。目前長期不進展者的保護機制仍未徹底闡明,對這一人群的研究對于明確HIV的致病機制及人體抗感染免疫應答至關重要,可為艾滋病的疫苗設計及治療提供重要靶點。

HIV感染需要細胞表達CD4分子及趨化因子受體,趨化因子受體或其配體的基因突變CCR2-641、SDF1-3′A和CCR5A32可保護宿主,延緩病程的發展[1]。國外及我們的前期研究顯示,CD4+T細胞趨化因子受體的表達水平同樣與艾滋病疾病進程相關,感染HIV后CD4+T細胞趨化因子受體CCR5表達水平增加,而CXCR4表達水平下降[2,3],但外周血CD4+T細胞趨化因子受體表達水平是否與HIV感染長期不進展狀態有關尚無報道。靜息細胞主要表達CXCR4,活化細胞則主要表達CCR5,我國經采供血HIV感染長期不進展者趨化因子受體表達是否與免疫活化狀態有關,目前尚未見報道。我國經采供血傳播的感染者與經性、吸毒等感染者相比,感染時間相對明確,可準確定義長期不進展者。本研究通過對河南、吉林等地經采供血感染,病毒亞型均為B′的44例長期不進展者進行了研究,并與相同感染途徑的無癥狀HIV感染者、艾滋病人進行對比,對CD4+T淋巴細胞趨化因子受體表達與疾病進展的關系進行了探討。

1 材料與方法

1.1 研究對象 165例未經抗病毒治療的HIV/AIDS患者來自中國河南、吉林、遼寧省,感染途徑均為既往有償采全血和/或單采血漿,經本實驗室病毒序列分析病毒亞型均為B′,未接受抗病毒治療。依據感染時間、CD4+T細胞數量及臨床癥狀將HIV感染者進行分期:長期不進展組(LTNP)感染時間大于10年,CD4+T細胞＞500個/μ l,無艾滋病指征性癥狀;無癥狀HIV感染組(HIV)CD4+T細胞介于200～500個/μ l之間,無艾滋病指征性癥狀;艾滋病組(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),CD4+T細胞＜200個/μ l或出現艾滋病指征性癥狀。依據上述分期標準,本研究病例中長期不進展組43例,HIV組82例,AIDS組35例。未暴露于HIV的健康對照40例。四組年齡、性別經One Way ANOVA或卡方檢驗比較后均無差異。研究對象一般狀況及基本病毒學、免疫學狀況見表1。

1.2 實驗設備及試劑 主要實驗設備及試劑均購自美國BD公司,包括流式細胞儀(FACSCalibur),EDTA抗凝管,絕對計數管,TriTEST CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP抗體,單克隆抗體:FITC標記的抗CD4和抗 CD8單抗、PE標記的抗 CD38、抗CCR5和抗CXCR4單抗及PerCP標記的抗CD3、抗HLA-DR單抗。

1.3 CD4+T細胞趨化因子受體及淋巴細胞活化水平檢測 FACSCalibur流式細胞儀檢測研究對象全血T淋巴細胞活化(HLA-DR、CD38)及CCR5、CXCR4表達情況。應用以下FITC/PE/PerCP標記單抗組合進行染色:CD4/CCR5/CD3;CD4/CXCR4/CD3;CD4/CD38/HLA-DR;CD8/CD38/HLA-DR。室溫孵育 30分鐘,加入溶血素3ml,室溫孵育8分鐘,1200 r/min離心5分鐘,棄上清。加入2 ml PBS懸浮,室溫,1 200 r/min離心5分鐘,洗滌兩次。加入1%多聚甲醛的 PBS 200 μ l懸浮,FACS CELLQuest軟件進行檢測分析。

1.4 CD4+T細胞絕對值及病毒載量檢測 CD4絕對值采用單平臺法應用BD公司FACSCalibur流式細胞儀MultiSET軟件檢測。病毒載量采用RT-PCR方法,用美國Roche公司的COBAS AMPLICOR自動載量儀測定病毒載量。

表1 HIV/AIDS患者一般狀況及基本病毒學、免疫學狀況(±s)Tab.1 Clinical and immunological characteristics of included subjects(±s)

表1 HIV/AIDS患者一般狀況及基本病毒學、免疫學狀況(±s)Tab.1 Clinical and immunological characteristics of included subjects(±s)

Groups LTNP(n=43) HIV(n=82) AIDS(n=35) NC(n=16)Age(years) 41.5±7.0 42.7±7.8 44.1±9.4 42.4±8.6 Males 62.8% 52.4% 51.4% 43.8%CD4 count,cells/μ l 675±155 357±80 148±89 794±247 Plasma HIV RNA,log10 copies/ml 3.20±1.13 4.11±0.81 4.56±0.90 N/A N/A%CD4+CCR5+T cell 11.92±7.01 19.50±11.53 25.25±15.88 10.96±11.67%CD4+CXCR4+T cell 70.57±18.12 70.43±21.66 73.98±16.88 69.46±13.87%CD4+HLA-DR+T cell 13.34±8.06 15.78±11.37 35.33±17.71 9.38±6.98%CD8+HLA-DR+T cell 36.52±15.55 34.71±17.81 54.75±16.38 25.14±15.18%CD4+CD38+T cell 72.49±10.30 73.21±10.13 72.89±15.86 59.98±14.55%CD8+CD38+T cell 77.30±15.42 85.18±9.88 90.01±7.03 56.80±15.00

1.5 流式細胞儀分析 用于三色熒光標記法流式細胞術測定的激發光為氬離子激光488 nm譜線,使用前向散射角(FSC)及側向散射角(SSC)確定淋巴細胞群,再分別以CD4+、CD8+T淋巴細胞為門,分析CD4+、CD8+T淋巴細胞表面活化分子HLA-DR、CD38的表達。CCR5、CXCR4表達:用FSC及SSC 確定淋巴細胞群,以CD3+T淋巴細胞為門,分析CD4+T淋巴細胞表面CCR5、CXCR4的表達。

1.6 統計學分析 用SPSS13.0軟件包對資料進行方差分析,全部數據用±s表示。各組間數據的比較采用ONE-ANOVA方法比較,用Spearman相關分析趨化因子受體CCR5、CXCR4表達與病毒載量、CD4+T淋巴細胞數量、T淋巴細胞活化(HLA-DR、CD38)的相關性。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 HIV感染長期不進展者CD4+T淋巴細胞趨化因子受體表達水平 用流式細胞儀方法檢測HIV感染者及健康對照趨化因子受體表達水平,發現LTNP組CD4+T細胞表面CCR5的表達明顯低于HIV組及AIDS組(P＜0.01),與健康對照無顯著差異;CD4+T細胞表面CXCR4的表達 LTNP組、HIV組、AIDS組無顯著差異。數據見圖1。結果顯示,LTNP組CD4+T細胞CCR5表達水平要低于典型進展的HIV及AIDS組,維持正常水平。

圖1 HIV感染長期不進展者CD4+T淋巴細胞趨化因子受體表達水平Fig.1 Chemokine receptor expression on CD4+T cells in HIV infected long term nonprogressors

2.2 HIV感染長期不進展者T淋巴細胞活化水平

淋巴細胞活化可影響趨化因子受體表達水平,我們對HIV感染者淋巴細胞活化水平進行了分析,發現LTNP組 HLA、CD38在 CD4、CD8+T細胞的表達低于HIV組及AIDS組,高于健康對照,其中除CD38在CD4+T細胞的表達外,其余指標LTNP組均顯著低于AIDS組(P＜0.05);除HLA在CD4+T細胞的表達外,其余指標 LTNP組均顯著高于健康對照(P＜0.05);LTNP組與HIV組各活化指標間無顯著差異,數據見表1。結果表明,感染HIV后,盡管LTNP組免疫活化水平較健康對照升高,仍低于HIV及AIDS組。

2.3 HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細胞趨化因子受體表達水平與CD4+T細胞、病毒載量及淋巴細胞活化的相關性 為探討趨化因子受體表達是否與疾病進展及免疫活化水平相關,我們對上述指標之間的相關性進行了研究,結果顯示 CD4+T細胞表面CCR5的表達與CD4+T細胞數量顯著負相關(r=-0.498,P＜0.05),與病毒載量無顯著相關性。CXCR4的表達與CD4+T細胞數量、病毒載量無顯著相關性。CD4+T細胞表面CCR5的表達與HLA、CD38在CD4、CD8+T細胞的表達水平顯著正相關(P＜0.001;HLACD4:r=0.428,HLACD8:r=0.266,CD38CD8:r=0.389),CD4+T細胞表面CXCR4的表達與HLA在CD4、CD8+T細胞的表達水平顯著負相關(P＜0.01;HLACD4:r=-0.268,HLACD8:r=-0.254)。結果表明,CD4+T細胞CCR5表達與疾病進展關系密切,其表達水平的變化與CD4+T細胞數量及免疫活化水平密切相關。

3 討論

上世紀80年代及90年代早期,我國部分地區經非法單采血漿等途徑造成艾滋病病毒在供血(賣血漿)員中的傳播。截至目前,陳舊獻血員中的多數感染者已進入發病期,但流行病學調查顯示,部分感染者感染時間已超過10年,CD4+T細胞仍大于500個/μ l,成為HIV感染疾病長期不進展者。對這部分人群免疫學等因素的深入研究有助于明確其抗病毒的保護性因素,為HIV的疫苗設計及治療提供線索。

趨化因子受體與配體結合后,可以引起粒細胞和單核巨噬細胞的定向遷移,對白細胞的活性及其功能的發揮有重要影響[4]。1996年,Feng等[5]發現部分趨化因子受體可作為HIV感染細胞的輔助受體,使其成為艾滋病防治的新靶點。HIV感染早期的病毒多應用趨化因子受體CCR5感染CD4+T細胞,晚期多應用CXCR4受體或兩個受體均可應用,趨化因子受體的表達水平可通過影響HIV對靶細胞的易感性及致病能力等影響疾病進程[6]。CCR5和CXCR4作為主要的輔助受體,其表達水平、基因型等在決定CD4+T細胞易感性中發揮了重要作用[7]。以往研究顯示,HIV感染后 CD4+T細胞CCR5表達升高,CXCR4表達降低[2],我們的前期研究也證實,我國HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細胞表面CCR5的表達增高[3],但CD4+T細胞趨化因子受體在長期不進展者中的表達情況目前尚無報道。我們對經血HIV感染長期不進展者的研究中發現,長期不進展者CD4+T細胞表面CCR5的表達水平明顯低于HIV組及AIDS組,與健康對照并無顯著差異,表達水平與CD4+T細胞數量顯著負相關,提示靶細胞低水平的CCR5表達與疾病長期不進展狀態相關。國外研究顯示,CD4+T細胞表面CCR5的密度越高,病毒載量越高,如細胞表面CCR5數量低于1萬個,則該細胞對HIV-1的易感性明顯降低[8],我們觀察到的長期不進展者CD4+T細胞CCR5表達水平低可能通過降低靶細胞對病毒的易感性從而延緩疾病進展。我們并未發現長期不進展者CD4+T細胞CXCR4表達與典型進展者的差別,前期研究也未觀察到典型進展者與健康對照這一指標的差異[3],提示靶細胞表面CCR5的表達在評價HIV感染者免疫狀態及預測疾病進展等方面具有更重要作用。

國外研究顯示,細胞活化水平是影響趨化因子受體表達的重要因素之一[2,7]。CCR5主要表達在活化的淋巴細胞表面,CXCR4主要表達在靜息細胞表面。淋巴細胞活化可誘導表面活化標志物表達,其中HLA-DR作為經典的活化標志物,其增高與T細胞功能缺失相關,且隨HIV疾病進展增高[9],CD38則表達在早期造血細胞表面,細胞成熟后消失,活化后再次表達,是HIV感染疾病進展的重要標志之一[10]。我們應用HLA-DR及CD38對淋巴細胞活化水平進行了研究,發現長期不進展者淋巴細胞活化水平高于健康對照,但明顯低于典型進展者,CD4+T細胞表面CCR5的表達與T細胞活化水平顯著正相關,焦艷梅等[11]亦發現中國HIV感染長期不進展者CD4+T細胞活化程度沒有明顯增高,提示長期不進展者CD4+T細胞CCR5表達水平較低與其低水平的細胞活化狀態有關。我們還發現CD4+T細胞表面CXCR4的表達與活化水平顯著負相關,提示隨著HIV感染細胞活化水平的增加,靜息細胞數量的下降將導致CXCR4表達水平的下降。

綜上,我國經采供血感染HIV的長期不進展者CD4+T細胞表面趨化因子受體CCR5表達維持較低水平,與低水平的淋巴細胞活化相關,為探討長期不進展者的保護機制,評價感染者免疫狀態及預測疾病進展提供了有益數據。

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