血管內皮細胞生長因子表位肽體外抗腫瘤作用研究①

趙 鑫 王 宏 向軍儉 朱中松 宋其芳 鄧 寧

(暨南大學生命科學技術學院抗體工程研究中心,廣州 510632)

VEGF作為血管形成和通透性誘導因子[1],其表達水平與原發腫瘤的大小、血管生成、淋巴管轉移等多種因素成正相關[2,3],因此已成為抗腫瘤血管新生治療中理想的靶分子之一。

噬菌體表面展示技術自Smith于1985年首次闡明以來,已得到長足進步,被廣泛應用于生物、醫藥及化學結構分析等領域。噬菌體表面展示的融合蛋白與編碼該蛋白的DNA序列直接相關,根據該DNA序列可自我復制的特性,能很容易直觀地識別和擴增目的蛋白克隆。并且表達于噬菌體表面的融合蛋白能表現出與其相應天然蛋白一樣或相似的功能及特點。本研究通過計算機模擬得到一系列VEGF相關表位序列,用噬菌體展示技術將其展示于噬菌體表面,檢測這些多肽在抗腫瘤增殖和抗血管新生方面的效用,從而篩選有明顯抗腫瘤、抗血管形成的多肽片段,為抗腫瘤多肽疫苗藥物研發打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 原代HUVEC細胞由中山大學中山醫學院高國全教授惠贈,高轉移細胞B16F10購自南京凱基生物有限公司,B16細胞、pCANTAB5-E、VCSM13、XL1-Blue均系本實驗室保存,RPMI1640和DMEM培養基購自Gibco公司,M199培養基購自Hyclone公司,小牛血清購自蘭州民海生物有限公司,ECGS、MTT、ECM gel均購自 Sigma公司,Transwell購自Corning公司,T4連接酶購自NEB公司,HindⅢ、NotⅠ以及T載體連接試劑盒購自TaKaRa公司,膠回收、質粒提取試劑盒購自Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 VEGF表位肽載體pCANTAB5-E的構建 根據pCANTAB5-E載體序列以及人VEGF189基因序列設計引物序列(見表1),由上海生物工程技術有限公司合成。第一輪PCR體系中加入等體積的P1、P2引物,94℃預變性5分鐘,94℃變性5分鐘,55℃退火5分鐘,72℃延伸5分鐘,7個循環進行PCR。第二輪PCR則以第一輪PCR產物為模板,分別加入P3、P4引物各1 μ l,94℃變性40秒,56℃退火 35秒,72℃延伸40秒,30個循環進行PCR得到目標序列。將第二輪 PCR產物切膠回收,連入T載體,轉入XL1-Blue菌中,經培養挑取單菌落,提取質粒并鑒定,行DNA序列分析,檢定序列的正確性。通過HindⅢ和NotⅠ對pCANTAB5-E和VEGF表位肽T載體分別進行雙酶切反應,37℃水浴酶切16小時。將載體片段與表位肽片段按摩爾比1∶6,于16℃水浴連接24小時。將連接后的pCANTAB5-E/VEGF重組載體轉化XL1-Blue菌株,經培養挑取單克隆,提質粒進行酶切鑒定。

1.2.2 噬菌體展示VEGF表位肽 挑取單個XL1-Blue菌落,接種到4ml 2×YT培養液中,待培養至對數生長期時 ,取稀釋度為 1011、109、107、105、103、101pfu/ml的 VCSM13 100 μ l,分別與 上述 100 μ l XL1-Blue菌液混合,室溫靜置30分鐘。42℃水浴下,加入融化的2×YT頂層培養基至3ml,吹打混勻,加入無抗性的2×YT底層培養基上,平衡至室溫后37℃培養過夜。取分隔良好的噬斑,加入5 ml呈對數生長期的XL1-Blue菌液中,37℃,220 r/min培養5小時,經12 000 r/min離心5分鐘,收集上清,得到擴增的VCSM13,以2×YT培養液稀釋至 10-10和10-12。取各稀釋度的噬菌體 100 μ l,分別與 100 μ l對數生長期的XL1-Blue菌液混合,37℃培養過夜,調整噬菌體VCSM13滴度為2.0×1013pfu/ml。取10 μ l轉入pCANTAB5-E/VEGF表位肽載體的XL1-Blue菌液,加入4 ml 2×YT培養液(含有50 mg/L Amp)37℃振蕩培養(220 r/min)過夜。取上述菌液1 ml,加入200 ml 2×YT培養液(含有50 mg/L Amp)中,37℃振蕩培養(220 r/min)至OD600nm≈0.6。加入輔助噬菌體1 ml,室溫靜置30分鐘,加入Kan至70 mg/L,37℃振蕩培養(220 r/min)過夜。次日收集菌液,8 000 r/min離心10分鐘,取上清分別加入等體積的飽和硫酸銨,冰浴沉淀3小時。8 500 r/min離心,收集沉淀,加滅菌DMEM溶解沉淀。測VEGF噬菌體表位肽的滴度為VSB:4.6×1012pfu/ml,VNB:1.1×1012pfu/ml,VEB:1.9×1012pfu/ml,VTB:3.7×1012pfu/ml。

1.2.3 ELISA法檢測噬菌體表位肽 用兔抗人VEGF多抗(9 ng/100 μ l)包被酶標板,37℃2小時;常規洗板3次;加入5%脫脂奶粉(200 μ l/孔),37℃封閉1小時;常規洗板3次;加入不同稀釋度的噬菌體表位肽,并設立VCSM13對照、空白對照,100 μ l/孔,37℃,1小時;常規洗板3次;加入抗噬菌體HRP酶標二抗(1∶2 500)100 μ l/孔,37℃,30 分鐘;常規洗板 5次;加底物顯色液(TMB)100 μ l/孔,避光 10分鐘 ,加 2 mol/L H2SO4(50 μ l/孔)終止反應,測定各孔OD450 nm值。

1.2.4 VEGF表位肽對內皮細胞增殖抑制作用 取對數生長期的原代HUVEC細胞,以5 000/孔的細胞數加入96孔板,用含10%小牛血清的M199培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養 24小時;換用含0.2%小牛血清的M199培養液繼續培養24小時至單層細胞狀態;加入不同稀釋度的噬菌體表位肽、設立VCSM13噬菌體對照和空白對照,于37℃、5%CO2培養箱中培養48小時;加入MTT溶液(5 g/L)20 μ l/孔,37℃繼續孵育3小時,棄孔內培養上清,加入DMSO(150 μ l/孔),振 蕩 10 分鐘,測 定各孔 492 nm吸收值A,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。

表1 PCR引物堿基序列Tab.1 Sequences of primers for PCR

1.2.5 VEGF表位肽對內皮細胞成管抑制作用 根據Levchenko等[4]的研究方法,將 ECM gel置于4℃活化過夜,按1∶1比例與DMEM 混勻后,鋪于 96孔板中(60 μ l/孔),室溫靜置 5分鐘。取原代HUVEC細胞,以1.5×104/50 μ l的濃度加入鋪好ECM gel的96孔板中。取VEGF表位肽VSB、VNB、VEB、VTB用基本培養基稀釋至1010pfu/ml并設立空白對照組和同滴度的VCSM13對照組,加入96孔板中,于37℃5%CO2培養箱中培養5小時后觀察拍照(40×)。

1.2.6 VEGF表位肽對腫瘤細胞增殖抑制作用 取對數生長期的B16細胞,以5 000/孔的細胞數分別加至96孔板中,用含10%小牛血清的DMEM培養基于37℃、含5%CO2恒溫培養箱中培養24小時;換用含0.2%小牛血清的DMEM培養液,繼續培養24小時至單層細胞狀態;加入不同稀釋度的噬菌體表位肽并設立VCSM13噬菌體對照組和空白對照組,于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養48小時;加入MTT(5 g/L)溶液,20 μ l/孔 ,37℃孵育 3 小時 ,棄孔內培養上清,加入 DMSO(150 μ l/孔),振蕩 10 分鐘,測定各孔492 nm吸收值A,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。

1.2.7 VEGF表位肽對腫瘤細胞遷移抑制作用 根據Chan等[5]的研究方法,在放入Transwell小室的24孔培養板中,于小室下層加入含10%小牛血清的RPMI1640完全培養基600 μ l。在小室上層加入濃度為5×105ml-1高轉移細胞株 B16F10懸液 100 μ l,并相應加入VSB、VNB、VEB和VTB噬菌體表位肽(1010pfu/ml),設立同稀釋度VCSM13對照和空白對照。在37℃5%CO2培養箱中培養18小時后取出小室,70%乙醇中固定15分鐘,Giemsa染色15分鐘,用棉簽輕輕將小室上層的細胞擦去、風干。顯微鏡下計數,計算細胞遷移率。細胞遷移率%=用藥組/Control組×100%,并拍照。

1.3 統計學處理 不同用藥組不同濃度的數據比較用重復測量數據方差分析進行檢驗,各組數據結果用±s表示,以 P＜0.05作為顯著性差異的標準。

2 結果

2.1 pCANTAB5-E/VEGF表位載體轉入XL1-Blue菌株挑取單克隆進行酶切鑒定 為確定插入了VEGF表位肽序列的pCANTAB5-E載體是否順利轉入XL1-Blue中并得以表達,從培養板上挑取單克隆小提質粒,用HindⅢ 和NotⅠ進行雙酶切,行電泳鑒定,如圖1所示,4株表位肽(VSB、VNB、VEB、VTB)片段分布在100～200 bp之間,表明該4株表位肽均被成功構建于目的載體上并順利表達。

2.2 噬菌體展示VEGF表位肽的表達水平 用兔抗人VEGF多抗經ELISA法測定結果顯示,與相同稀釋度的對照組VCSM13相比,VSB、VNB、VEB、VTB噬菌體表位肽在1/125稀釋度時與抗VEGF多抗仍有結合(P＜0.05),表明這四株表位肽與抗VEGF多抗發生抗原抗體結合反應,由此可知四株表位肽順利展示于噬菌體表面,見圖2。

圖1 噬菌體表位肽VSB、VNB、VEB、VTB單克隆酶切鑒定Fig.1 Identification of peptides VSB,VNB,VEB,VTB

圖2 噬菌體展示VEGF表位肽 VSB、VNB、VEB、VTB表達的ELISA鑒定結果Fig.2 Identification of expression for peptides of VSB,VNB,VEB,VTB by ELISA

2.3 VEGF噬菌體表位肽對HUVEC細胞增殖的影響 MTT法檢測VEGF噬菌體表位肽在不同稀釋度條件下對原代HUVEC增殖的抑制情況,OD492nm檢測各孔吸光度A值,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。結果顯示,與空白對照組相比,經1/10濃度稀釋度的VSB、VNB、VEB、VTB表位肽對HUVEC 細胞增殖的抑制率超過50%,其中表位肽VNB對HUVEC細胞增殖的抑制率最高達到了(64.8±3.3)%(P＜0.05),如圖3所示。

圖3 噬菌體表位肽抑制HUVEC細胞增殖作用Fig.3 Inhibition rate of peptides on HUVEC proliferation

2.4 VEGF噬菌體表位肽對HUVEC細胞成管作用的影響 ECM gel法檢測VEGF噬菌體表位肽對原代HUVEC成管作用的影響,加表位肽作用5小時后顯微鏡下觀察拍照(40×),如圖4所示。Control組為空白對照組,原代HUVEC在ECM gel中遷移排列成線形結構,并相互交叉成網狀,即形成血管雛形,如圖中箭頭所示。VCSM13對照中也形成了相應的線形網狀結構。而加入表位肽的實驗組中,VSB、VTB組雖然有部分HUVEC排列成線形,但與對照組相比,其線形結構數量少且沒有形成較為明顯的網狀結構,表明這兩株VEGF表位肽對HUVEC細胞的成管具有明顯的抑制作用。

2.5 VEGF噬菌體表位肽對B16細胞增殖的影響MTT法檢測VEGF噬菌體表位肽在不同稀釋度條件下對黑色素瘤細胞B16增殖的抑制情況,OD492nm檢測各孔吸光度A值,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(空白對照組A值-加藥組A值)/空白對照組A值×100%。結果顯示,與空白對照組相比,在1/30濃度稀釋度的VSB、VNB、VEB、VTB表位肽作用下,B16細胞增殖的抑制率均超過50%。其中,VEB表位肽對B16增殖的抑制率達到(75.7±6.6)%,VTB表位肽對B16增殖的抑制率也達到(66.5±6.3)%(P＜0.05),如圖5所示。

圖4 噬菌體表位肽抑制HUVEC細胞成管作用(40×)Fig.4 Inhibition of peptides on tube formation of HUVEC(40×)

圖5 噬菌體表位肽抑制B16腫瘤細胞增殖作用Fig.5 Inhibition rate of peptides on B16 proliferation

圖6 噬菌體表位肽抑制B16F10細胞遷移作用Fig.6 Inhibition of peptides on B16F10 migration

圖7 噬菌體表位肽抑制B16F10腫瘤細胞遷移(100×)Fig.7 Inhibition of peptides on B16F10 migration(100×)

2.6 VEGF噬菌體表位肽對B16F10細胞遷移的影響 Transwell模型檢測4株表位肽對高轉移細胞株B16F10遷移作用的影響,40×鏡下進行細胞計數,計算細胞遷移率,細胞遷移率%=用藥組/Control組×100%。結果表明VEGF的VSB、VNB、VEB、VTB表位肽對高轉移細胞株B16F10的遷移有明顯抑制作用,與空白對照組相比,抑制遷移率均超過80%,其中VEB實驗組細胞遷移率僅為(3.9±0.6)%(P＜0.05),如圖6所示。圖7為100×鏡下顯微鏡觀察圖,圖中呈深色細長菱形結構的為遷移到Transwell小室下層膜上的B16F10細胞,由圖可知,空白對照組和VCSM13對照組,均有大量B16F10細胞遷移至小室下層膜上,而用藥組VSB、VNB 、VEB、VTB 中 ,成功遷移至小室下層的B16F10細胞數目較少。以上結果表明這四株表位肽均具有明顯抑制高轉移細胞株B16F10遷移的作用。

3 討論

研究表明,在乳腺癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤等多種腫瘤組織內、外都可檢測到大量VEGF及其受體,VEGF在腫瘤組織血管新生方面發揮著極其重要的作用[6]。因此,抑制VEGF生物學活性有可能對抑制腫瘤增生、發展產生巨大影響。近年來與VEGF相關的腫瘤治療方面取得了不少成果,如抗VEGF單克隆抗體Bevacizumab(商品名Avastatin)、Ranibizumab(商品名Lucentis)已經上市;VEGF抑制劑Pegaptanib(商品名Macugen)已獲FDA批準;專門針對肝癌、腎癌和胃腸道癌治療的VEGFR的抑制劑Sorafenib(商品名Nexavar)和Sunitinib(商品名Sutent)也已獲得FDA批準[7]。然而,這些藥物也有一些缺點,如用量大、費用高、只能對一種或兩種腫瘤發揮效用。鑒于此,多肽小分子藥物以其用量少、費用低、生物活性強、具有廣譜性的優點走進了人們視線并逐漸引起專家和學者的關注。

多肽類藥物主要包括多肽疫苗、抗腫瘤多肽、多肽導向藥物、細胞因子模擬肽、抗菌性活性肽、診斷用多肽及其它藥用小肽等七大類。其中,抗腫瘤多肽常用化學合成或從動物、天然植物中提取獲得,在體內外取得抑制腫瘤增殖和血管新生的效果。如Hehir等[8]人工合成的2個多肽在裸鼠荷瘤模型的研究結果表明,對人宮頸癌細胞Hela的抑制率達到70%,并且都具有抑制血管生成的作用。在細胞因子及其受體模擬肽的研究方面,學者們也發現了一些具有抗腫瘤生長效用的短肽,如Maruta等[9]用人胚視網膜細胞篩選得到的與FGFs沒有同源性的保守基序MXXP,合成了7肽MQLPLAT,該短肽能夠與bFGF競爭結合FGFR,并且能導向到腫瘤組織,發揮抗腫瘤活性;又如Bae等[10]從合成肽組合文庫中篩選到一種能結合VEGF的六肽,并能抑制VEGF與受體結合,阻斷VEGF誘導的雞胚尿囊膜和兔角膜的血管新生,還可抑制人結腸癌細胞HM7的生長和轉移。但這些具有抗腫瘤療效的模擬肽與相關的人源性細胞因子同源性并不高。

本研究通過計算機模擬出4株VEGF表位多肽,用噬菌體展示技術獲得。體外實驗結果證明,這些VEGF同源多肽,在抑制黑色素瘤細胞、血管內皮細胞增殖、遷移、成管方面具有較為顯著的作用。特別是VNB(MRCGGCCNDEGLECVPTEE)對HUVEC細胞的增殖抑制率達到 64.8%,而VEB(CGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKN)、VTB(KARQLELNERTCRCDK)對B16細胞增殖抑制率也分別達到了75.7%和66.5%。Transwell實驗中,4株表位肽抑制高轉移細胞株B16F10遷移率均超過80%,這說明,這些表位肽在抗黑色素瘤增殖、遷移以及抗血管新生方面有著巨大的潛力。

有研究發現,部分多肽的抗腫瘤作用在于腫瘤細胞膜磷脂分布的非對稱性被破壞,造成磷脂酰乙醇胺(PE)與磷脂酰絲氨酸(PS)多出現在細胞膜外側,于是多肽鏈里的帶正電荷的極性氨基酸與帶負電荷的PS相互結合,使得腫瘤細胞膜外側聚集了大量多肽片段,其中非極性氨基酸通過疏水作用介入細胞膜形成膜孔,導致腫瘤細胞因基質外流而死亡,從而起到殺死腫瘤細胞的作用[11,12]。通過分析VSB、VNB、VEB、VTB表位肽氨基酸序列后發現,VEB和VTB分別具有一段連續的、5個以上親水性氨基酸的多肽片段,易于聚集在腫瘤細胞膜周圍,發揮抗腫瘤作用。在未來研究中,如果能順利解決多肽易于被體內蛋白酶水解的問題,這幾株表位模擬肽將會在抗腫瘤治療方面發揮其巨大作用。此外,通過進一步分析這些肽段的氨基酸序列后,可以將其連接在多聚賴氨酸骨架上形成一個具有獨特三維空間結構的大分子疫苗,誘導機體產生抗VEGF抗體,從而在腫瘤組織中與VEGFR競爭結合高表達的VEGF,達到抗腫瘤的目的。這4株表位多肽還可以與其他細胞因子如bFGF、PDGF的模擬肽聯合用藥形成復合模擬肽,共同作用于腫瘤組織,與細胞因子競爭結合腫瘤組織大量表達的細胞因子受體等,達到更強的抗腫瘤目的。

本研究篩選得到的VEGF模擬肽以VEGF和VEGFR相互作用為目標,探討小分子多肽對抗腫瘤及抗血管新生方面的效用,對腫瘤抑制藥物以及腫瘤導向性藥物的開發和研究具有十分重要的參考價值。

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