外源性TGF-β1對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠中IL-23/Th17炎癥軸的影響①

黃國祥 王玉忠 周文斌 肖 波 吳志國 梁靜慧 (中南大學湘雅醫院神經內科,長沙 410008)

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是一種主要由CD4+T細胞介導的、以中樞神經系統(Central nervous system,CNS)炎性脫髓鞘性為特征的自身免疫性疾病,因其與多發性硬化(Multiple sclerosis,MS)有著相似的臨床及病理表現而成為研究MS的理想模型,其具體發病機制目前尚未明確。

Th17細胞是新近發現的輔助性CD4+T細胞,它通過分泌IL-17A(即 IL-17)、IL-17F和TNF-α等因子而發揮促炎作用。IL-17作為IL-17家族的代表性因子,已經發現在EAE中表達升高,IL-17-/-小鼠對EAE不敏感[1]。IL-23是IL-12家族新成員,由p19和p40兩個亞基組成,其中p40亞基為IL-12和IL-23兩者所共有。研究發現,IL-23對于維持Th17細胞的功能具有重要的作用,而IL-23參與的Th17細胞介導的炎癥反應即IL-23/Th17炎癥軸被認為在自身免疫性疾病的發生、發展中起了至關重要的作用[2]。

早有研究發現轉化生長因子β1(Transforming growth factor beta1,TGF-β1)能減輕MS 的病情[3],但TGF-β1對MS的作用機制仍不清楚。本研究參照Mendel造模方法[4]建立慢性EAE模型并給予外源性TGF-β1,擬觀察EAE小鼠病情變化和不同時期IL-23p19、IL-17和IL-6的動態表達,探討TGF-β1在EAE中可能的作用機制,以期為MS的臨床治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 72只健康雌性C57BL/6小鼠,清潔級,8～10周,委托中南大學動物學部代為購買。MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLY RNGK)由西安美聯多肽合成有限公司合成(純度＞97%);百日咳毒素購自List Biological,Campbell,CA;完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司;小鼠IL-17、IL-23、IL-6 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;小鼠 IL-17、IL-23p19、IL-6及內參GAPDH 引物由上海生工技術有限公司合成。GAPDH:Sense:5′-GCTACAGCTTCACCACA-3′,Anti-sense:5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,產物大小為107 bp;IL-23p19:Sense:5′-CCAAAGGAGGTGGATAGG-3′,Anti-sense:5′-TGTCAGAGTCAAGCAGGT-3′,產物大小為 402 bp;IL-17:Sense:5′-GGCCAAGGACTTCCTCCA-3′,Anti-sense:5′-CAGCTTTCCCTCCGCATT-3′,產物大小為 211 bp;IL-6:Sense:5′-CTGATGCTGGTGACAACCAC-3′Anti-sense:5′-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3′,產物大小為175bp。

1.2 EAE模型的建立 72只C57BL/6小鼠隨機分為EAE組、佐劑組、干預組和假干預組。其中EAE組:以免疫當天為第0天,用抗原乳劑200 μ l(由100 μ g MOG35-55、100 μ l完全弗氏佐劑和 100 μ l PBS 組成)皮下注射免疫;第7天以同樣劑量重復免疫。于免疫當天和48小時,每只小鼠經腹腔注射百日咳毒素200 ng。佐劑組僅注射完全弗氏佐劑,劑量同EAE組;干預組在免疫同時用TGF-β1進行干預,具體為0、3、5、6、8、9、11 天多點皮下注射,每只小鼠每次注射 1 μ g TGF-β1;假干預組,用PBS代替TGF-β1進行干預。

從初次免疫第0天起至第32天實驗終止前,采用盲法,每天2人至少一次在同一時間按Benson評分標準[5],對實驗小鼠進行臨床評估。評分標準為:1分:尾部無力或蹣跚步態伴尾部有力;2分:蹣跚步態伴尾部無力(共濟失調);2.5分:共濟失調伴部分單肢麻痹;3分:單肢完全麻痹;3.5分:單肢完全麻痹伴另一肢體部分麻痹;4分:雙肢完全麻痹;4.5分:四肢麻痹;5分:死亡。分別在發病初(16天)、高峰期(22天)、慢性期(32天)處死小鼠,取部分腦組織行HE和Weil氏染色觀察病理改變(圖1)。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應 一步法提取腦組織總RNA,逆轉錄合成cDNA,行PCR擴增,然后進行PCR產物瓊脂糖凝膠電泳,于Tanon GIS-2020電泳凝膠圖像分析儀中測量各產物的光密度。PCR反應條件:94℃預變性5分鐘;循環35次(95℃變性45秒,59℃退火45秒,72℃延伸1分鐘),最后72℃延伸10分鐘。

1.4 酶聯免疫吸附法 采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒檢測外周靜脈血分離所得血漿中IL-17、IL-23和IL-6的水平,在規定的有效期內嚴格按說明書操作使用,并判定結果。

2 結果

2.1 實驗動物臨床評分和體重變化 EAE組在發病初期毛色發暗,活動減少,反應遲鈍,食欲較差,體重明顯減輕,臨床評分隨著時間延長加重,臨床癥狀有多種表現,例如:尾部無力,蹣跚步態,雙后肢爬行困難,不能站立,或呈偏癱步態,在原地劃圈樣走動;在慢性期部分小鼠癥狀稍減輕,活動量較前略增加,反應仍較遲鈍,體重沒有進一步下降。佐劑組小鼠食欲好,形態活潑,反應靈敏,尾部有張力。干預組小鼠發病臨床表現基本同EAE組,但發病時間提前,高峰期更為嚴重,而在慢性期更趨向于緩解;假干預組臨床表現、發病時間和嚴重程度基本同EAE組。具體見圖2、3。

圖1 EAE小鼠腦中病理表現Fig.1 The representation of brain in EAE group

圖2 實驗小鼠臨床評分變化Fig.2 The variance of clinical scores of experimental mice

圖3 實驗小鼠的體重變化Fig.3 Weight variance of experimental mice

圖4 實驗小鼠各期腦中IL-23p19、IL-17和IL-6的mRNA表達Fig.4 The expression of IL-23p19,IL-17 and IL-6 mRNA in cerebra of experimental mice during different phase

圖5 實驗小鼠各期外周血漿中IL-23的表達Fig.5 The expression of IL-23 in the peripheral blood plasma of experimental mice during each phase

表1 實驗小鼠腦中IL-23p19 mRNA的動態表達(±s)Tab.1 The dynamic expression of IL-23p19 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

表1 實驗小鼠腦中IL-23p19 mRNA的動態表達(±s)Tab.1 The dynamic expression of IL-23p19 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

Note:1)P＜0.01,vs control group;2)P＜0.05,vs EAE group or notho-intervention group;3)P＜0.05,vs onset.

Groups Onset Peak point Chronic phase Control group 0.166±0.026 0.168±0.032 0.159±0.032 Notho-intervention group 0.715±0.0291) 0.584±0.0251) 0.585±0.0411)EAE group 0.706±0.0181) 0.596±0.0331)3) 0.580±0.0221)Intervention group 0.790±0.0191)2) 0.490±0.0191)2) 0.480±0.0231)2)Note:1)P＜0.01,vs control group;2)P＜0.05,vs EAE group or notho-intervention group;3)P＜0.05,vs onset.表2 實驗小鼠腦中IL-17 mRNA的動態表達(±s)Tab.2 The dynamic expression of IL-17 mRNA in cerebra of experimental mice( ±s)Groups Onset Peak point Chronic phase Control group 0.142±0.026 0.158±0.012 0.154±0.005 Notho-intervention group 0.611±0.0351) 0.727±0.0251) 0.707±0.0371)EAE group 0.613±0.0291) 0.726±0.0271)3) 0.704±0.0211)Intervention group 0.654±0.0141)2) 0.757±0.0181)2) 0.642±0.0121)2)

表3 實驗小鼠腦中IL-6 mRNA的動態表達(±s)Tab.3 The dynamic expression of IL-6 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

表3 實驗小鼠腦中IL-6 mRNA的動態表達(±s)Tab.3 The dynamic expression of IL-6 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

Note:1)P＜0.01),vs control group;2)P＜0.05,vs EAE group or notho-intervention group.

Groups Onset Peak point Chronic phase Control group 0.140±0.018 0.166±0.024 0.153±0.014 Notho-intervention group 0.720±0.0261) 0.718±0.0121) 0.724±0.0281)EAE group 0.728±0.0161) 0.721±0.0281) 0.727±0.0231)Intervention group 0.759±0.0291)2) 0.757±0.0241)2) 0.756±0.0171)2)

圖6 實驗小鼠各期外周血漿中IL-17的表達Fig.6 The expression of IL-17 in the peripheral blood plasma of experimental mice during each phase

圖7 實驗小鼠各期外周血漿中IL-6的表達Fig.7 The expression of IL-6 in the peripheral blood plasma of experimental mice during each phase

2.2 RT-PCR結果 分別計算IL-23p19/GAPDH、IL-17/GAPDH、IL-6/GAPDH得出各指標的光密度相對值并進行比較。

IL-23p19、IL-17和IL-6在各組各期表達變化具體見表1～3和圖4～7。

3 討論

以前的研究認為IL-12在Th1細胞介導的自身免疫性疾病如多發性硬化中發揮了關鍵性的作用,然而新近的研究認為,IL-23可能較IL-12在EAE中發揮著更為關鍵的作用[6,7]。本實驗中 IL-23在EAE發病初期表達即升高,這提示 IL-23可能與EAE的發病有關。Thakker等[8]從MOG免疫的小鼠中提取出致病性的T細胞,注入野生型和 IL-23p19-/-小鼠,兩組均能產生EAE。這提示致病性T細胞一旦成熟產生,就很少依賴IL-23,即IL-23更可能在疾病的早期發揮作用,而本實驗中IL-23在高峰期和慢性期表達下降,這也證明IL-23主要在模型的誘導初期發揮作用。

IL-17作為Th17細胞分泌的關鍵性因子之一,已被發現在多種自身免疫性疾病中表達升高。IL-6來源多樣,可以由樹突狀細胞、巨噬細胞、星形膠質細胞分泌;其作用復雜,可在多種途徑多個水平對其他細胞和細胞因子產生影響。本實驗中,IL-17表達在發病初期表達升高,并在高峰期進一步升高,慢性期略有下降,而IL-6在整個病程均呈高表達,這說明IL-17和IL-6與EAE的發病密切相關。Veldhoen等[9]發現由分枝桿菌誘導的Th17細胞分化必須依賴TGF-β1和 IL-6存在。Ogura等[10]認為在EAE中IL-17可以通過正反饋回路誘導IL-6的產生從而增強自身免疫。Serada等[11]發現IL-6的缺陷可以抑制EAE中抗原特異性Th17細胞的產生以及Th1型細胞免疫,使用IL-6抗體可以抑制EAE的發病。我們認為在EAE的發病中,IL-6聯合TGF-β1可以誘導致病性Th17細胞的分化,后者分泌大量的IL-17并進一步誘導IL-6的分泌,后者通過級聯反應導致中樞神經系統髓鞘的破壞。然而本實驗發現IL-6在EAE各期均呈高表達,且在慢性期IL-17表達降低時其表達依然增高,我們認為在發病初期和高峰期,IL-6的高表達與IL-17的正反饋有關[10],而在慢性期IL-6依然呈高表達可能與慢性期炎癥反應的維持有關,這可能存在其他的調節機制,有待進一步的研究。

TGF-β1屬于生長因子超家族,它具有多重調節功能。在TGF-β1干預組中,與EAE組相比,IL-23在發病初期表達更高,而在高峰期和慢性期表達更低;經TGF-β1干預后,EAE小鼠發病提前,這也支持IL-23可能主要在EAE模型誘導初期發揮作用的結論。在干預組中,IL-17在發病初期、在高峰期的表達較EAE組更高,而在慢性期表達下降;IL-6在整個病程均呈高表達。在臨床癥狀上,經TGF-β1干預后的EAE小鼠高峰期癥狀更重,而在慢性期更趨向于緩解,這說明IL-17的表達與EAE疾病的嚴重程度呈正相關。研究發現,TGF-β1的免疫調節功能呈現劑量依賴性,低濃度時表現為協同IL-6誘導Th17細胞的分化,而在高濃度時則誘導CD4+CD25+調節性T細胞的分化,其中前者可以誘導EAE的發生而后者介導免疫抑制[12]。本實驗中,我們對干預組采用多個時間點重復注射TGF-β1,我們認為在干預之初,在低劑量的條件下,TGF-β1的功能主要表現為協同IL-6誘導Th17的分化,后者分泌IL-17并進一步誘導IL-6的高表達;隨著注射劑量累積的增多,TGF-β1的功能又表現為誘導Treg細胞的分化,這與干預組小鼠的臨床表現是相符合的。研究發現,IL-23對于Th17細胞的存活、增殖以及IL-17的分泌至關重要[13]。這與本實驗干預組中發病初IL-23的表達上調以及干預組小鼠發病提前、高峰期癥狀更重是相符合的。然而TGF-β1如何影響IL-23的表達,其機制尚不清楚。

總之,本研究驗證了IL-23/Th17細胞炎癥軸在EAE發病中的重要性;IL-23在早期的免疫啟動中可能發揮著關鍵性的作用;外源性的TGF-β1通過上調IL-17的表達使得EAE的發病提前,高峰期癥狀更重;同時經干預后,EAE在慢性期更趨向于緩解。我們期望本文能為MS的臨床治療提供指導,然而EAE/MS的發病是多種免疫因子共同作用的結果,TGF-β1能否用于MS臨床治療,仍需進一步的研究。

1 Komiyama Y,Nakae S,Matsuki T et al.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2006;177(1):566-573.

2 Kikly K,Liu L,Na S et al.The IL-23/Th(17)axis:therapeutic targetsfor autoimmune inflammation[J].Curr Opin Immunol,2006;18(6):670-675.

3 Mangan P R,Harrington L E,O'Quinn D B et al.Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)17 lineage[J].Nature,2006;441(7090):231-234.

4 Mendel I,Kerlero de Rosbo N,Ben-Nun A.A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice:fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells[J].Eur J Immunol,1995;25(7):1951-1959.

5 Benson J M,Stuckman S S,Cox K L et al.Oral administration of myelin basic protein is superior to myelin in suppressing established relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,1999;162(10):6247-6254.

6 Cua D J,Sherlock J,Chen Y et al.Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain[J].Nature,2003;421:744-748.

7 Hunter C A.New IL-12-family members:IL-23 and IL-27,cytokines with divergent functions[J].Nat Rev Immunol,2005;5(7):521-531.

8 Thakker P,Leach M W,Kuang W et al.IL-23 is critical in the induction but not in the effector phase of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2007;178(4):2589-2598.

9 Veldhoen M,Hocking R J,Flavell R A et al.Signals mediated by transforming growth factor-β initiate autoimmune encephalomyelitis,but chronic inflammation is needed to sustain disease[J].Nat Immunol,2006;7(11):1151-1156.

10 Ogura H,Murakami M,Okuyama Y et al.Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction[J].Immunity,2008;29(4):628-636.

11 Serada S,Fujimoto M,Mihara M et al.IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008;105(26):9041-9046.

12 Zhou L,Lopes J,Chong M et al.TGF-β-inducedFoxp3 inhibitsTh17 cell differentiation by antagonizing ROR γ t function[J].Nature,2008;453(7192):236-240.

13 Veldhoen M,Hocking R J,Atkins C J et al.TGF beta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells[J].Immunity,2006;24(2):179-189.