壯族人群少精不育患者精細胞GSTT1和GSTM1基因研究①

陳文成 康熙雄 韋葉生 潘 云 周亞莉 張國軍 (右江民族醫學院醫學檢驗學院,百色 533000)

根據世界衛生組織估計,全球有近6000萬人罹患不孕癥,約占育齡人口的10%。其中近一半由男性因素所致,稱為男性不育[1]。導致男性不育的原因很多,其中相關基因的突變是一個重要的因素。大量的研究表明,人體內特別是生殖腺里的毒性物質對精子的成熟和精液的質量有很大影響,谷胱甘肽轉硫酶(Glutathione s-transferase,GST)能催化多種Ⅰ相酶代謝活化產生的毒性代謝產物與谷胱甘肽(GSH)巰基(-SH)共軛結合,形成親水性物質排出體外,從而提高機體的解毒作用。GST幾乎廣泛存在于人體所有的細胞和組織,尤其在生殖腺、肝臟、結腸中表達較高,其基因的缺失和人體對環境中毒性物質的解毒能力相關,從而影響到精子的成熟和精液的質量,導致男性不育。

本工作運用PCR法對75名壯族少精不育患者精細胞GSTT1和GSTM1基因進行多態性研究,探討壯族人群中該基因多態性與少精癥的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 實驗組:75例均為少精癥(精子密度＜20×109L-1且精子形態正常在45%以下,精子活率在30%～60%之間),年齡25～40歲,平均 32歲,婚后不育年限2～8年,平均3.5年。所有患者性功能正常,無生殖系統器質性病變及炎癥、阻塞等。檢測前抽靜脈血檢查染色體核型(G顯帶技術)、抗精子抗體(ELISA)及血清激素水平,異常者不列入研究對象。對照組:36例為已生育且精液正常(精子密度≥20×109/L,A級精子＞25%或A+B級精子＞50%)的健康男性,年齡25～40歲,平均32.5歲。研究對象禁性生活3天后,取精液檢查,連續2次異常予以確診。精液標本均來自右江民族醫學院附屬醫院檢驗科,研究對象均為壯族人。

1.2 實驗方法 精液DNA提取:吸取精液200 μ l,加1ml滅菌生理鹽水混勻,5 000 r/min離心5分鐘,棄上清,加STE直至加到溶液均一、不混濁,37℃水浴1 小時 ,加蛋白酶K(終濃度 100 μ g/m1),55℃水浴3小時,加等體積酚/氯仿,12 000 r/min離心5分鐘,吸上清于另一管中,加2倍體積無水乙醇。置-20℃沉淀30分鐘,12 000 r/min離心15分鐘。棄上清,自然干燥,加TE液10 μ l,混勻,4℃保存待用。

1.3 PCR反應體系 引物設計參照文獻[2]的報道,由上海生工生物工程技術有限公司合成。GSTM1 引物:正向 5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′,反向 5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′;GSTT1 引物:正向 5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′,反向 5′-TCACCGGATCATGGCCAGGCGCA-3′。 內對照β-globin 基因引物:正向 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′;反向 5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′。 反應體積為 25 μ l,含基因組 DNA 0.5 μ g,2.5 mmol/L MgCl2,200 μ mol/L dNTP,上下游引物各 0.5 μ mol/L,1U Taq DNA聚合酶。PCR循環:94℃60秒,59℃30秒,72℃80秒,共32個循環。將擴增的PCR產物加在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,電流45 mA,電壓100 V,電泳載樣緩沖液為1×TBE緩沖液,用溴乙錠染色,在紫外燈下觀察結果。

1.4 結果判斷 有電泳條帶者為GSTM1基因攜帶者(present),無顯示則為缺失(deleted)。

1.5 統計學分析 實驗組和對照組的基因(型)頻率比較分析用 χ2檢驗,用SPSS軟件包進行分析。

2 結果

2.1 結果判斷 精細胞基因經PCR擴增后,將擴增的PCR產物加在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳,用溴乙錠染色,在紫外燈下觀察結果,有電泳條帶者為GST基因攜帶者(present),無顯示則為缺失(deleted)。GSTT1 為 480 bp、GSTM1為 215 bp,內對照 βglobin為268 bp,見圖1。

圖1 精細胞GSTM1和GSTT1基因電泳圖Fig.1 PCR product of GSTM1 and GSTT1 genes

表1 GSTM1基因分析Tab.1 Analysis of the GSTM1 genotypes AA,AG,and GG

表2 GSTT1基因分析Tab.2 Analysis of the GSTT1 genotypes AA,AG,and GG

表3 GSTM1和GSTT1基因分析Tab.3 Analysis of the GSTM1 and GSTT1 genotypes AA,AG,and GG

2.2 實驗組與對照組GSTM1基因多態性比較 結果如表1,實驗組的缺失型基因高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 實驗組與對照組GSTT1基因多態性比較 結果如表2,實驗組的缺失型基因與對照組比較,差異沒有統計學意義(P＞0.05)。

2.4 實驗組與對照組GSTM1基因、GSTT1基因多態性同時比較 結果如表3,實驗組的均缺失型基因與對照組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

男子不育癥的發病原因復雜,多種因素均可以影響男性生育力,包括染色體異常、生殖道感染、睪丸生精功能異常、精子結構異常和精漿異常、男性性功能障礙等。其中部分與遺傳因素有關,深入研究各種基因變異導致生殖損傷的分子作用機理,可以進一步揭開男性不育的奧秘,從而維護和促進人類生殖健康。

GSTs是一組具有多種生理功能的超基因家族酶系[3]。它能催化機體內有害極性化合物與谷胱甘肽相結合,還可由非酶結合方式將體內各種潛在毒性代謝產物、染料致癌劑及親脂性化合物從體內排出,從而參與機體內抗氧化和保護細胞內許多物質合成、儲存和轉運的過程[4],因此GSTs在解毒功能上起著重要作用,是參與代謝外源性和內源性化學物質的重要酶系,與人體健康和疾病有著密切的關系[5],國外已經有研究顯示GSTM1和GSTT1基因多態性和男性特發性不育癥有密切聯系[6]。GSTs分布較廣,幾乎廣泛存在于人體所有的細胞和組織,尤其在生殖腺中表達較高,許多外源性誘導劑或損傷性刺激均可引起細胞內GSTs異常表達[7]。由于GSTs同工酶亞型種類的多樣化,所以分類也較復雜,目前研究最多的是GSTT1和GSTM1基因多態,因為這兩個基因都存在純合性缺失這一多態現象[8],GSTM1和GSTT1基因缺失可導致相應酶活性降低或無結合活性。

本研究發現,實驗組與對照組GSTM1和GSTT1基因多態性進行比較,實驗組GSTM1基因及GSTM1+GSTT1組合的缺失型基因均高于對照組(58.7%∶33.3%,45.3%∶19.4%),差異有統計學意義(P＜0.05),說明GSTM1與壯族人群少精癥患者有著密切的聯系。需要強調的是與男性不育的相關基因很多,而且這些基因并不是單獨起作用的,而是與其他基因一起對男性生殖系統發揮作用,有研究顯示:組合基因缺失對DNA的生物學影響比單個的基因變異大[5],因此在研究男性不育相關基因時,我們也應該著眼于多基因研究。從本試驗結果可以看出,GSTT1基因在兩組間的比較并無統計學意義(P=0.56),但是GSTT1+GSTM1基因組合其缺失型在壯族人群少精癥患者中出現頻率卻較高,差異有統計學意義(P＜0.05),說明GSTT1和GSTM1一起,與壯族人群少精癥患者可能也有一定的關系。正常人受到有毒化學物質的刺激后,GSTM1和GSTT1表達增高,起到解毒作用,以免細胞受損。正是由于GSTM1和GSTT1在體內物質代謝中有很重要的作用,當GSTM1和GSTT1基因發生突變或缺失時,體內的有毒物質代謝將受影響,與生殖系統相關的一些有毒物質將得不到及時的降解和排出,在體內蓄積到一定程度后即可通過氧化應激等作用危害男性生殖器官的功能,影響生精過程,使精子數目下降、畸形率上升、精子活動力下降、卵子受精率下降等,從而引起不育。GST在人群中存在遺傳多態性,多態性包括基因的完全或部分缺失,可以導致GSTT1及GSTM1蛋白的酶活性丟失。這種多態性與人體對環境中毒性物質的解毒能力相關,從而影響到個體對疾病的易感性,影響精子的成熟和精液的質量。這一點可因不同的種族、地域而存在相應的差異[9]。

精液主要由精子和精漿兩部分組成。研究發現,精液中的代謝產物如氧自由基、二氧化碳、組胺等會影響到精子的成熟及運動[10]。而GSTM1和GSTT1則是參與代謝外源性和內源性化學物質的重要酶系,當其缺乏時,精液中的代謝物的轉化將受影響,氧化過程中對機體有害的產物聚集,從而影響到精子的成熟與質量。大量的研究表明[11],精液內存在大量有毒代謝產物可以使睪丸的精子發生減退,引起精子凝集。其活性產物(蛋白酶、細胞因子等)通過精子膜過氧化等機制對精子的形態結構和功能造成損害而影響生育力,例如畸形精子比例增加、尖頭精子和尾部畸形精子顯著增加等。

由本研究結果可以看出:精細胞GSTM1基因和GSTT1+GSTM1基因多態性與壯族男性少精癥有著較為密切的聯系。但由于人類生殖的復雜性,盡管對男性不育的研究已經有了大量的臨床和實驗基礎的積累,人類對自身生殖的了解仍然非常有限,人類生殖還有很多未解之謎。相信隨著醫學科學的發展,很多謎底都將被揭開,特別是隨著人類基因組測序的完成和功能基因組計劃的開展,為研究男性不育的基因機制及它對睪丸、附睪功能的影響提供了條件,男性不育的機制和診治終將會得到解決。

2 Gaspari L,Pedotti P,Bonafe M et al.Metabolic gene polymorphisms and p53mutations in healthy centenarians and younger controls[J].Biomarkers,2003;8(6):522-528.

3 Van der Logt E M,Bergevoet S M,Roelofs H M et al.Genetic polymorphisms in UDP-glucuronosyltransferases and glutathione S-transferases and colorectal cancer risk[J].Carcinogenesis,2004;25(12):2407-2415.

4 Patel B P,Rawal U M,Rawal R M et al.Tobacco,antioxidant enzymes,oxidative stress and genetic susceptibility in oral cancer[J].Am J Clin Oncol,2008;31(5):454-459.

5 陳文成,潘尚領,林偉雄 et al.巴馬縣長壽老年人代謝相關基因及抑癌基因的多態性研究[J].中華老年醫學雜志,2008;27(4):281-282.

6 Finotti A C,Costa E Silva R C,Bordin B M et al.Glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphism in men with idiopathic infertility[J].Genet Mol Res,2009;8(3):1093-1098.

7 李蘇平,吳建中,丁建華 et al.GSTM1、GSTT1基因多態性和飲酒習慣與原發性肝癌發生的危險性[J].實用癌癥雜志,2004;19(3):229-232.

8 Kondo S,Sturgis E M,Li F et al.GSTM1 and GSTT1 null polymorphisms and risk of salivary gland carcinoma[J].Int J Clin Exp Med,2009;2(1):68-75.

9 韓艷波,馮向先,李佩珍.CYP1A1、GSTM1基因多態性與食管癌遺傳易感性[J].中國公共衛生,2005;21(1):3-6.

10 Lanzafame F M,La Vignera S,Vicari E et al.Oxidative stress and medical antioxidant treatment in male infertility[J].Reprod Biomed Online,2009;19(5):638-659.

11 Miki K.Energy metabolism and sperm function[J].Soc Reprod Fertil Suppl,2007;65:309-325.