重組人促甲狀腺激素β亞基的切膠純化及多克隆抗體制備①

李敬華 柳明波 馬 彥 左愛(ài)軍 孫 蓓 梁東春 郭 剛

(天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院/內(nèi)分泌研究所,衛(wèi)生部及天津市激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300070)

目前國(guó)內(nèi)科研及檢測(cè)所需抗hTSH抗體主要依賴于國(guó)外公司生產(chǎn),嚴(yán)重制約了國(guó)內(nèi)科研及相關(guān)工作的開(kāi)展。本室自行構(gòu)建了hTSH β鏈的原核表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)了重組GST-hTSHβ融合蛋白,進(jìn)一步純化后可做為免疫原來(lái)制備抗hTSH β鏈的抗體。由于大分子重組蛋白在大腸桿菌中高水平表達(dá)時(shí)易于形成包涵體。雖然易于將包涵體與可溶性蛋白分開(kāi),但自包涵體中溶解出目的蛋白則需經(jīng)過(guò)洗滌、溶解、復(fù)性和透析脫鹽等多步,在這個(gè)過(guò)程中易造成蛋白變性、濃度降低,致使動(dòng)物免疫時(shí)不能保持足夠的抗原性和濃度要求。本實(shí)驗(yàn)用切膠純化法純化了GST-hTSHβ重組蛋白,并運(yùn)用該蛋白免疫了新西蘭大耳朵白家兔,成功制備了相應(yīng)的高效價(jià)抗血清。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 含有pGEX-3X/hTSHβ重組質(zhì)粒的E.coli DH5α菌株由本室構(gòu)建及保存[1];BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,免疫佐劑氫氧化鋁購(gòu)自美國(guó)Pierce公司;雄性新西蘭大耳朵白家兔購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,人促甲狀腺激素(hTSH)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白胨、酵母粉均為Sigma分裝。

1.1.2 器材 ∑960型全自動(dòng)酶標(biāo)測(cè)定儀(美國(guó)Metertech公司);96孔酶標(biāo)板(丹麥Nunc公司);電泳儀(PowerPacTMHC,Power Supply BIO-RAD);垂直電泳槽(Mini-PROTEAN 3,Cell BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 重組GST-hTSHβ在 E.coli DH5α中的誘導(dǎo)表達(dá) 將-80℃保存的含有 pGEX-3X/hTSHβ的 E.coli DH5α菌株復(fù)蘇后,挑取單菌落接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)14～16小時(shí),按1∶100接種于相同的培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)3～5小時(shí),當(dāng)A600達(dá)到0.6左右后,加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4～6小時(shí)后離心收獲細(xì)菌,超聲碎菌后,8 500 r/min 4℃離心15分鐘分別收集沉淀及上清行SDS-PAGE。

1.2.2 切膠制備GST-hTSH β重組蛋白 配制1.5 mm厚度3.3%的濃縮膠和10%的分離膠,將適量包涵體用1 ml 1×上樣緩沖液懸浮,沸水浴5分鐘,進(jìn)行還原型SDS-PAGE。電泳結(jié)束后取下凝膠,在預(yù)冷的去離子水中漂洗5分鐘,預(yù)冷的0.25 mol/L KCl溶液浸泡10分鐘,蛋白條帶呈現(xiàn)乳白色。準(zhǔn)確切割下含有GST-hTSHβ蛋白樣品的凝膠置于研缽中加入液氮充分研磨成粉末狀。加入500 μ l 0.01 mol/L PBS(pH 7.5)充分溶解、混勻后,使用空針式濾器過(guò)濾后-20℃保存[2]。BCA法測(cè)定所得GST-hTSHβ溶液的蛋白濃度,按照BCA測(cè)定試劑盒說(shuō)明操作。SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)R250染色及 Western blot對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫 雄性大耳朵白家兔正常飼養(yǎng)一周,觀察無(wú)異常后進(jìn)行首次免疫。取適量GST-hTSHβ蛋白溶液與同體積氫氧化鋁免疫佐劑混合,室溫持續(xù)攪拌30分鐘。首次免疫抗原量按100 μ g/kg于家兔背部皮下10～12點(diǎn)注射;分別于首次免疫后7、28、42、56天進(jìn)行加強(qiáng)免疫,抗原量減半。每次免疫前從兔耳緣靜脈采血3 ml,分離血清后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 兔抗hTSHβ抗體效價(jià)測(cè)定 ELISA檢測(cè)兔抗hTSHβ抗血清效價(jià)。以購(gòu)買(mǎi)的 hTSH 20 μ g/ml,100 μ l/孔4℃過(guò)夜包被96孔酶標(biāo)板。將免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采集的兔血清用PBST進(jìn)行系列稀釋(1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000,1∶8 000,1∶12 000),以 PBST(0.01 mol/L PBS含0.05%Tween-20 pH7.4)100倍稀釋免疫前兔血清作為陰性對(duì)照。包被好的酶標(biāo)板洗板后加入1%BSA 溶液 200 μ l/孔,37℃溫育30分鐘;洗板后分別加入陰性對(duì)照或不同稀釋度的免疫后血清各100 μ l,37℃30分鐘,洗板后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 工作液(1∶5 000 稀釋)100 μ l,37℃30分鐘,洗板后加入TMB底物,室溫顯色15分鐘后加入終止液,使用酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度值,并以實(shí)驗(yàn)組吸光值≥2倍陰性對(duì)照組吸光值時(shí)的最大稀釋度作為該抗體的效價(jià)。

1.2.5 血清收集及飽和硫酸銨逐級(jí)沉淀粗提IgG首次免疫42天后麻醉下采集家兔血液,獲得抗血清。取血清20 ml,加入等體積0.01 mol/L PBS(pH 7.4)混勻,于4℃緩慢逐滴加入預(yù)冷的飽和硫酸銨溶液40 ml,輕輕攪拌混勻后4℃靜置過(guò)夜;離心(4℃,12 000 r/min)10分鐘,棄上清;沉淀用12 ml 0.01 mol/L PBS溶解后,緩慢逐滴加入預(yù)冷的飽和硫酸銨溶液8 ml,4℃靜置1小時(shí);同上離心后,棄上清;沉淀用13.4 ml 0.01 mol/L PBS溶解,緩慢逐滴加入預(yù)冷的飽和硫酸銨溶液6.6 ml,4℃靜置1小時(shí);再次離心,棄上清,沉淀用少許0.01 mol/L PBS溶解,裝入預(yù)處理的透析袋中(透析袋用去離子水煮沸10分鐘,換液后重復(fù)一次);在4℃冷柜中用20倍體積0.02 mol/L PBS持續(xù)透析3天,期間換液數(shù)次;透析后溶液經(jīng)離心(4℃,3 000 r/min,20分鐘)后取上清,用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度,分裝后保存于-80℃。分別用于以下兩種方法純化。

1.2.6 DEAE纖維素柱離子交換層析純化IgG 稱取20 g DEAE-32纖維素干粉,用0.5 mol/L NaOH 200 ml浸泡30分鐘,抽濾后用去離子水洗至中性;再用0.5 mol/L HCl 200 ml浸泡30分鐘,抽濾后用去離子水洗至中性;再用0.5 mol/L NaOH 200 ml浸泡30分鐘,抽濾后用去離子水洗至中性。隨后以600ml 0.02 mol/L PBS(pH 7.4)懸浮,常溫下靜置 4小時(shí)后傾去細(xì)微顆粒。將平衡好的DEAE-32纖維素?cái)嚻鸷笱毓鼙诘谷牒幸话胫?.02 mol/L PBS的層析柱中。取適量體積上述粗純的IgG上樣,收集流出液測(cè)定蛋白含量后分裝凍存于-80℃。

1.2.7 Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法[3]純化IgG

稱取Protien A SEPHAROSE CL-4B干粉250 mg,加3.5倍體積PBS充分溶脹,室溫平衡過(guò)夜。將溶脹好的柱料注入層析柱,使自然沉降。沉好后的柱料約1 ml。用大于5倍柱床體積的PBS沖洗柱料,然后將經(jīng)飽和硫酸銨粗提后蛋白200 μ l上于柱料上層,4℃靜置過(guò)夜。用PBS充分清洗,去除雜蛋白。然后用0.1 mol/L的甘氨酸-HCl(pH 2.8)洗脫目的蛋白。用0.01 mol/L PBS透析后用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量,并分裝凍存于-80℃。

2 結(jié)果

2.1 GST-hTSHβ融合蛋白的切膠純化 對(duì)比重組質(zhì)粒pGEX-3X/hTSHβ和空質(zhì)粒pGEX-3X的表達(dá)產(chǎn)物可見(jiàn),重組GST-hTSHβ蛋白在大約42 kD左右有大量表達(dá)(圖1),主要以包涵體形式存在。目的蛋白占碎菌沉淀樣本總蛋白的百分比為26.57%。BCA法測(cè)得碎菌沉淀總蛋白的濃度約為65.77mg/L培養(yǎng)基。經(jīng)估算,GST-hTSHβ融合蛋白的表達(dá)量約為17.48 mg/L培養(yǎng)基。切膠回收后的樣本于SDSPAGE中僅見(jiàn)GST-hTSHβ融合蛋白單一條帶(圖2)。經(jīng)BCA法測(cè)定該回收樣本的蛋白含量為14.92 mg/ml,切膠回收后目的蛋白的收率為85.33%。切膠純化后的GST-hTSHβ蛋白經(jīng) Western blot鑒定為目的條帶(圖3)。

圖1 GST-hTSH β重組蛋白表達(dá)SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of GST-hTSH β fusion protein

圖2 切膠純化后 GST-hTSH β SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of Gel purified GST-hTSHβ

2.2 ELISA測(cè)定免疫所得兔血清抗體效價(jià) 經(jīng)ELISA測(cè)定后判定該兔免疫28、42、56天后的抗hTSH的抗體效價(jià)分別達(dá)到了1∶4 000、1∶8 000和1∶12 000(圖 4)。

圖3 切膠純化后GST-hTSH β Western blot鑒定Fig.3 The analysis of G el purified GST-hTSH β by Western blot

圖4 兔血清抗體效價(jià)ELISA檢測(cè)Fig.4 Anti-hTSH β specific antibody titers in sera of immunized rabbit by ELISA

圖5 兩種方法純化IgG效果比較Fig.5 Comparision of two methods purified IgG

2.3 兩種方法純化多克隆抗體IgG效果的比較采用BCA法測(cè)定蛋白含量,經(jīng)計(jì)算,20 ml血清中經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后血清IgG含量為12.28 mg,平均分成2份,一份用離子交換純化法后 IgG含量在2.61 mg左右,Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法純化后IgG含量在4.87 mg左右。采用非還原型 SDSPAGE測(cè)定IgG純度,結(jié)果如圖5,得到了一定純度的抗體。

3 討論

小分子蛋白質(zhì)作為免疫原時(shí)很難刺激起較高的免疫學(xué)反應(yīng),這對(duì)于制備高效價(jià)抗體來(lái)說(shuō)是很不理想的。為了獲得高效價(jià)的抗體多將該類分子與大分子蛋白如BSA等相偶聯(lián),以期增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫學(xué)反應(yīng),這一方法已被廣泛應(yīng)用并獲得了良好的效果[4]。但是偶聯(lián)的過(guò)程本身較為復(fù)雜,同時(shí)會(huì)損失部分樣品,對(duì)于較珍貴的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其代價(jià)昂貴。本研究中的重組hTSHβ蛋白也存在該問(wèn)題,故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之初就考慮為其加上GST標(biāo)簽,一方面增加了重組蛋白的免疫原性,另一方面為純化該蛋白打下了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用市售的hTSH標(biāo)準(zhǔn)品,而非免疫所用的GST-hTSHβ重組蛋白來(lái)監(jiān)測(cè)兔血清中抗TSHβ抗體的效價(jià),既避免了抗GST抗體對(duì)效價(jià)的影響,也證實(shí)了該抗體對(duì)正常的hTSH有很好的識(shí)別。

免疫所產(chǎn)生抗體的特異性很大方面取決于所使用的免疫原的純度。因此,如欲獲得高特異性的抗體,必須先予純化抗原。不同的重組蛋白需要采用不同的純化方式,通常要用到凝膠過(guò)濾,離子交換和親和層析等純化方法[5]。這些方法的應(yīng)用對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和儀器設(shè)備要求較高,而且在獲得蛋白質(zhì)高純度的同時(shí)也帶來(lái)了低收率的弊病。對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)是很難承受蛋白純化過(guò)程中的花費(fèi)和繁瑣的。本室構(gòu)建的GST-hTSHβ融合蛋白在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之初擬采用GST親和層析純化,但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)所純化的融合蛋白并未能達(dá)到預(yù)期的純度且純化步驟煩瑣費(fèi)時(shí),往往一次所能純化的蛋白量很有限,為獲得所需蛋白用量需多次反復(fù)進(jìn)行。切膠免疫的應(yīng)用則為我們提供了便利,所分離的蛋白不僅純度高而且凝膠在研磨后可以起到類似于免疫佐劑樣的作用[6,7]。陳鴻軍[8,9]等的系列研究也證實(shí)切膠免疫尚能滿足單克隆抗體的制備。本實(shí)驗(yàn)用該法獲得的抗原成功制備出了hTSHβ的多克隆抗體,其陽(yáng)性血清效價(jià)達(dá)1∶12 000。因此,切膠免疫的方法完全可滿足動(dòng)物抗體制備的需求。與其他蛋白純化方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn):①簡(jiǎn)單易行:可以省去多次洗脫柱子處理柱子的繁瑣工作,無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備。②價(jià)格低廉:實(shí)驗(yàn)中所用的試劑均為普通試劑,容易得到且便宜,不需要昂貴的蛋白純化柱。③應(yīng)用范圍廣,可用于絕大多數(shù)蛋白的純化。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明了這種方法是便捷、高效、經(jīng)濟(jì)的。

對(duì)于經(jīng)飽和硫酸銨粗體后的多克隆抗體IgG,我們應(yīng)用兩種方法進(jìn)行純化,并比較純化效果。結(jié)果我們認(rèn)為兩種方法純化后IgG的純度保持一致,但是經(jīng)Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法純化后的IgG濃度較高。認(rèn)為Protien A瓊脂糖凝膠親和層析法是一種高純度、有實(shí)用價(jià)值的純化方法[10,11]。

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