觀察植物木質(zhì)部的3種切片方法比較

朱登峰 ，唐冬英 ，李明芳 ，劉選明

（1.海南大學農(nóng)學院，海南 儋州 571737；2.湖南大學生命科學與技術(shù)研究院，湖南 長沙410082；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101）

冷凍切片法、石蠟切片法和徒手切片法是實驗過程中常用的3種制作切片方法。冷凍切片主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學病理診斷[1]，適于開展細胞免疫化學和原位雜交等研究。這是因為它不需要將樣品經(jīng)過長時間的脫水包埋，能更好地保證抗原分子的穩(wěn)定性[2]。徒手切片法是直接利用手拿刀片將植物新鮮材料切成薄片，制成切片的一種方法。徒手切片簡便易行、不需要專門的技術(shù)和儀器設(shè)備，且在切片過程中不需要特殊的化學試劑處理（如脫水劑及包埋劑），因此在植物材料中廣泛應(yīng)用[3]。而石蠟切片法是用石蠟作為包埋劑的一種顯微制片方法，為顯微制片技術(shù)中最常用的方法之一。如石蠟永久制片、石蠟切片。為了更清楚有效地觀察植物木質(zhì)部結(jié)構(gòu)，本文采用了一種快速冷凍切片法，并與石蠟切片技術(shù)及徒手切片法進行比較，旨在探索出一種相對較好的細胞學切片方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍型油菜（Brassica napusL.）N529及擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）哥倫比亞生態(tài)型col-4為材料，OCT包埋劑，石蠟，二甲苯，F(xiàn)AA固定劑，36%甲醛，冰醋酸，乙醇，蒸餾水，1%的間苯三酚（95%乙醇配制）和25%的鹽酸等。

1.2 實驗方法

1.2.1 快速冷凍切片法 快速冷凍切片方法如下：取材→置于樣品托頭上→OCT包埋劑包埋→－30℃快速冷凍固定→切片→貼片→染色觀察。首先啟動Leica CM 1800冷凍切片機降溫開關(guān)，把機箱溫度降低至-25～-30℃，待溫度穩(wěn)定時，剪取油菜及擬南芥莖（長約0.1～0.3 cm）置于樣品托頭上，然后直接用OCT包埋劑進行包埋，涂抹均勻，使樣品深埋其中，再置于速凍架上，迅速冷凍并固定在樣品托頭上。包埋劑OCT變白后，把樣品托頭移至切片機的機頭上，擰緊機頭螺絲，搖動旋轉(zhuǎn)杠桿進行修塊切片。設(shè)置切片厚度（25～100 μm），進行切片，在切片上加1～2滴1%間苯三酚和25%鹽酸染色30 min；Nikon倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.2 徒手切片法 徒手切片法如下：取材→徒手切片→濕毛筆將薄片放人盛水培養(yǎng)皿中→挑選透明的薄片→載玻片上染色觀察。

1.2.3 石蠟切片法 石蠟切片法如下[4]：取材→FAA固定液固定24 h→脫水（依次50%、60%、70%、80%、90%、100%、100%乙醇每級1～2 h）→透明（1/2二甲苯+1/2乙醇、純二甲苯、純二甲苯每級2 h）→透蠟（2/3二甲苯+1/3石蠟4～8 h或過夜→1/3二甲苯+2/3石蠟2 h、純石蠟2 h、純石蠟2 h）→包埋→切片、貼片→展片→染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種切片的植物莖組織觀察

木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類聚合物，包圍于管胞、導(dǎo)管、木纖維等纖維束細胞及厚壁細胞外，并使這些細胞具有特定顯色反應(yīng)：加間苯三酚溶液數(shù)滴，待片刻，再加鹽酸數(shù)滴，即顯紅色；在倒置顯微鏡下觀察3種切片結(jié)構(gòu)，實驗過程中可以發(fā)現(xiàn)，快速冷凍切片在處理硬度較大的材料時，組織細胞間易破裂（圖1 A），而在處理油菜頂端莖組織和擬南芥嫩莖切片時，可得到較完整且清晰的切片（圖1 B、C）；石蠟切片和徒手切片結(jié)構(gòu)都很完整（圖1 D、E、F）。木質(zhì)素組織化學染色分析結(jié)果顯示石蠟切片經(jīng)過各級脫水處理后，染色對比度不好，木質(zhì)素染色顏色不深，為淡紅色。徒手切片容易產(chǎn)生視野較暗的切片（圖1 F），主要可能是切片透明度不夠，厚薄不均勻產(chǎn)生。

圖1 油菜和擬南芥主莖橫切面間苯三酚-HCl組織化學染色圖（100×）

2.2 3種切片方法的比較

3種細胞學切片方法的比較如表1所示，從表中可以看出，3種方法各有優(yōu)點和缺點。徒手切片法方法簡單，操作簡便，但切片質(zhì)量不高，對材料有要求；石蠟切片法切片質(zhì)量好，但操作繁雜，成本較高；快速冷凍切片法比較簡便、有效、易操作，能切出較高質(zhì)量的切片。

3 討論

在植物學及細胞生物學實驗上，切片制作的質(zhì)量非常重要，直接影響到教學和實驗的進展。通過應(yīng)用上述3種切片方法鑒定生物組織中的有機物質(zhì)，實驗結(jié)果顯示：3種方法都可以獲得細胞形態(tài)完整、組織結(jié)構(gòu)清晰、對比度較好的切片。徒手切片技術(shù)在植物學實驗中應(yīng)用較早、且比較普遍。它可以觀察新鮮材料組織和細胞的天然色彩，直接觀察活體細胞結(jié)構(gòu)狀態(tài)。通常不經(jīng)染色或經(jīng)簡單染色后，制成臨時的水裝片，亦可以通過脫水與染色制成永久制片。徒手切片易產(chǎn)生視野較暗的切片，結(jié)合石蠟切片的透明劑，觀察效果可能會更好。石蠟切片法為制片技術(shù)的經(jīng)典方法，是植物學、病理學和醫(yī)學等學科觀察及判斷細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的主要方法，也廣泛地用于生物教學實驗和其他許多學科領(lǐng)域的研究中。石蠟切片也與其他新技術(shù)相結(jié)合，如張舍郁[5]將免疫熒光檢測技術(shù)與石蠟切片相結(jié)合，用于抗原定位。它還用于細胞原位核酸分子雜交技術(shù)中[6-7]，可對材料中被雜交的DNA分子進行定位、定量分析或觀察分析基因表達（mRNA）水平。快速冷凍切片多應(yīng)用在細胞免疫化學和原位雜交等研究中，主要在于它能很好地保存細胞內(nèi)生物分子的活性，因此在動物和人體的組織研究中得以廣泛應(yīng)用。由于植物細胞有細胞壁和大液泡，含水量大，在低溫冷凍過程中容易形成冰晶，硬度變大，材料硬度太大是造成組織切片破碎的主要原因[8]，難以切出結(jié)構(gòu)完整的組織切片；而且細胞內(nèi)產(chǎn)生的冰晶會損傷細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)，影響其在植物細胞學、細胞免疫化學等研究中的應(yīng)用。細胞嚴重傷害主要發(fā)生在速凍的降溫及解凍的過程中[9]，因此普遍采用冷凍保護劑的方法來解決上述植物冷凍切片中存在的問題。陳丹[2]等用蔗糖保護-液氮速凍法及林月惠[10]用甘油作冷凍保護劑分別進行冷凍切片，從而獲得薄且結(jié)構(gòu)完整的切片；寧代鋒[11]等人采用冷凍切片技術(shù)結(jié)合適當回溫的方法也制作出了植物細胞基本結(jié)構(gòu)完整的切片。冷凍切片技術(shù)已逐漸在植物組織切片中得到應(yīng)用[12-15]。謝佩松[14]和劉劍鋒[15]等認為通過冷凍切片法可在短時間內(nèi)（1 d）獲得高質(zhì)量切片。在快速冷凍切片過程中切片不宜過薄過厚，切片太薄（小于10 μm）易碎、易卷曲；反之，切片太厚（大于50 μm），有皺折及折疊形成。快速冷凍切片法制作的切片，整體結(jié)構(gòu)完整，導(dǎo)管、木纖維細胞、韌皮纖維細胞及髓部薄壁細胞結(jié)構(gòu)清晰。實驗證實快速冷凍切片法是一種簡便有效的制作植物組織切片的方法。

表1 3種切片方法的比較

[1]Sathyanesan S N,Antonia D,Rose T,et al.A simplified method for combined immunohisto chemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen，cryocut mouse brain sections[J].Brain Research Protocols,2002,9:214-219.

[2]陳 丹，趙 潔.適合于植物花器官的冰凍切片技術(shù)[J].武漢植物學研究，2005，23（3）：285-290.

[3]李 巖，王幼群.徒手切片與植物細胞微管免疫熒光定位[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，1997，7（4）：382-385.

[4]李曉梅.大豆莖頂端分生組織石蠟切片的制備 [J].大豆科學，2008，27（4）：708-710.

[5]張舍郁，程安春，汪銘書，等.間接免疫熒光檢測石蠟切片中鴨腫頭出血癥病毒及抗原定位方法的初步建立 [J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（3）：868-874.

[6]程安春，廖永洪，朱德康，等.檢測石蠟切片中鴨病毒性腸炎病毒間接原位PCR方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（12）：4365-4371.

[7]王春燕，黃秀燕.適合植物組織原位雜交和原位PCR的切片制作[J].安徽農(nóng)學通報，2007，13（7）：37-38.

[8]劉劍鋒，程云清，閻秀峰.植物冰凍切片技術(shù)的改進[J].南京林業(yè)大學學報，2006，30（3）：128-130.

[9]曾繼吾，易干軍，張秋明，等.番木瓜莖尖超低溫保存過程中的細胞超微結(jié)構(gòu)[J].園藝學報，2005，32（1）：15-19.

[10]林月惠，李寒冰，賀新強.高度木質(zhì)化材料的冰凍切片技術(shù)[J].植物學通報，2001，18（1）：118-120.

[11]寧代鋒，尹增芳，張 菁，等.一種簡單快速植物組織冰凍切片方法[J].熱帶亞熱帶植物學報，2008，16（4）：386-389.

[12]張新成，李志剛，李素麗，等.冰凍切片法在植物微管骨架研究中的應(yīng)用[J].廣西植物，2008，28（2）：164-166.

[13]焦 石，段玉璽，孫 華，等.大豆根部冰凍切片最佳方法試驗[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48（4）：806-808.

[14]謝佩松，徐中根，韋存虛.冰凍切片技術(shù)在植物顯微結(jié)構(gòu)和組織化學中的應(yīng)用[J].生物學雜志，2009，26（3）：72-74.

[15]劉劍鋒，閻秀峰，程云清，等.冰凍切片技術(shù)在高山紅景天細胞學研究中的應(yīng)用[J].東北林業(yè)大學學報，2006，34（4）：110，119.