牡丹花蕾大小對花藥組培誘導率的影響

朱向濤，王 雁，彭鎮華，律春燕，鄭寶強，高云瑞

（中國林業科學研究院林業研究所，國家林業局林木培育重點試驗室，北京 100091）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.），屬芍藥科芍藥屬的名貴觀賞和藥用木本植物[1]，冠有“花中之王”美譽[2]。牡丹的組織培養研究已經有較長的歷史，近年來也取得了一定進展。但在牡丹花藥誘導愈傷組織方面仍然存在愈傷組織誘導困難、誘導率低、生長緩慢等問題[3-6]。關于花藥培養誘導率低的原因有很多，而花粉的發育時期是影響培養效果的重要因素之一，這在其他植物上如番茄[7]、黃瓜[8]、金銀花[9]已有較詳細的研究報道，而牡丹花粉的發育時期與花蕾大小相關性及其愈傷組織誘導率方面的研究尚未見報道。筆者通過對不同花蕾大小的牡丹花粉母細胞發育時期的觀察，探討了花蕾大小與花粉母細胞發育時期的相關性，并對不同發育時期的花藥進行愈傷組織誘導，以期通過花蕾大小的外觀判斷，推斷和確定花粉母細胞發育時期，從而為提高愈傷組織誘導率提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試牡丹品種為“鳳丹”，種植于中國林業科學研究院試驗田，田間管理按照常規方法進行。

愈傷組織誘導的培養基：MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，蔗糖6%，瓊脂0.7%，pH 5.8，121℃高壓滅菌 20 min。

1.2 方法

2008 年 4 月，于晴天上午 10：00～11：00 之間，從生長良好的植株上選取不同長度的花蕾，用游標卡尺測量花蕾長度后，分裝于卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定 24 h，經 95%、80%乙醇沖洗后轉入70%乙醇中4℃保存備用。采用醋酸洋紅壓片法壓片，顯微鏡觀察拍照。

每份材料取不同大小10個花蕾，3次重復，每個花蕾取1個花藥，每個花藥觀察10個不同視野，通過視野中花粉母細胞發育時期的細胞數與總細胞數比例來確定花粉母細胞發育時期。并對不同時期單個細胞進行顯微鏡拍照。

花藥接種時，自來水沖洗2 h，2%次氯酸鈉消毒20 min，無菌水沖洗4～5遍，70%酒精消毒20 s，之后再用無菌水沖洗4～5遍，用濾紙將多余水分吸干，在無菌條件下將花藥剝離接種。每處理接種10瓶，3次重復。接種后的花藥置于在（25±2）℃條件下暗培養，誘導愈傷組織。

2 結果與分析

2.1 牡丹各發育階段的細胞學特征

2.1.1 四分體時期 如圖1所示，花粉母細胞經過減數分裂形成四分體，四分體的4個小孢子被共同的胼胝質包被，各個小孢子之間也有胼胝質分割。

2.1.2 單核早期 如圖2所示，小孢子從四分體中釋放，細胞體積小，細胞質中無液泡，核大，居于中間位置。

2.1.3 單核中期 如圖3所示，細胞質中產生小液泡，細胞體積增加到正常大小，核大，居中央，特化細胞壁逐步形成，細胞壁周圍出現萌發孔。

圖1 四分體時期

圖2 單核早期

2.1.4 單核晚期 如圖4所示，隨著小孢子的發育，細胞質液泡化，出現小液泡，小液泡增多相互合并形成大液泡，將細胞核擠壓到靠近細胞壁。

圖3 單核中期

圖4 單核晚期

2.1.5 雙核期 如圖5所示，細胞核在靠近細胞壁位置進行有絲分裂形成兩個子核，其中一個較小并貼近細胞壁，為生殖核，另一個明顯較大而且處于近中央位置及營養核，營養細胞和生殖細胞構成了二細胞花粉。

2.2 花蕾長度與花粉母細胞發育的關系

如表1所示，花蕾長度在16.0～18.0 mm時，絕大多數花粉母細胞發育時期為四分體時期，有少數處于單核早期和單核中期，四分體時期的細胞數目占總細胞數目的92.4%。

表1 花粉母細胞發育時期與花蕾長度的相關性

在花蕾長度為18.0～20.0 mm時，多數花粉細胞的發育時期為單核早期，占到總細胞數目的87.5%，有少數細胞處于四分體時期和單核中期，極少數細胞已經發育到單核晚期。

花蕾長度在20.0～23.0 mm時，多數花粉細胞發育時期為單核中期，有部分細胞發育時期為單核早期和單核晚期，極少數細胞發育時期為雙核期，單核中期的細胞數目占細胞總數的91.5%。

當花蕾長度為23.0～25.0 mm時，花粉細胞中多數細胞的發育時期處于單核晚期，少數細胞的發育時期為單核早期和單核中期，另外有部分細胞的發育時期為雙核期，單核晚期的細胞數目占總細胞數目的82.9%。

花蕾長度為25.0～28.0 mm時，花粉細胞中大多數細胞處于雙核期，占總細胞數目的82.2%，少數細胞處于單核中期和單核晚期。

2.3 花藥不同發育時期愈傷組織誘導率

由表2可以看出，不同的發育時期的牡丹花藥都能誘導出愈傷組織，但誘導率有所不同。從四分體時期開始誘導率逐漸升高，在單核中期達到最高，其后逐漸降低。單核中期的愈傷組織誘導率為45.8%，其次為單核晚期，誘導率為18.3%。單核早期和雙核期愈傷組織誘導率均為13.3%，四分體時期愈傷組織誘導率僅為8.3%。誘導出的愈傷組織均為白色致密愈傷組織（圖6）。

表2 花粉不同發育時期對愈傷組織誘導的影響

圖5 雙核期

圖6 花藥誘導的愈傷組織

3 結論與討論

牡丹花藥培養過程中，取材時期具有關鍵性作用。在大規模的小孢子培養過程中，通過顯微鏡觀察每一個小孢子的發育時期是有很大困難的，因此，通過花蕾長度來簡單的判斷花粉的發育時期具有重要的作用。牡丹花粉的發育時期包括四分體時期、單核早期、單核中期、單核晚期和雙核期。在花藥發育的四分體時期，植物的花藥尚未發育完全，不利于誘導愈傷組織產生，而單核中期，細胞質中小液泡產生，細胞體積增加到正常大小，特化的細胞壁逐漸形成，此時的細胞生長最為旺盛，營養成分也較為充足。另外花粉進入單核期后，即將進入有絲分裂，此時花藥對誘導條件最為敏感，容易引起染色體軸向的改變，導致花粉細胞進行脫分化分裂而開始花粉脫分化，所以容易產生愈傷組織。這在觀賞茄[10]、仙客來[11]、羽衣甘藍[12]、中國水仙[13]等植物上也取得了同樣的結果。單核晚期由于細胞質中的小液泡聯合成為一個大的液泡，對誘導條件反應不夠敏感，所以誘導率較低。

本試驗確定在花蕾長度為20.0～23.0 mm時，牡丹的大多數花粉母細胞發育處于單核中期，此時期花粉誘導愈傷組織的誘導率達到最高的45.8%。實踐證明，在牡丹小孢子培養過程中，通過花蕾大小及形態特征的觀察，無需制片鏡檢，即可快速、準確地找到適合小孢子培養發的花蕾，可避免每次取樣時需要制片觀察確定小孢子發育時期的繁瑣程序，具有方便、快捷、準確的特點，有利于提高小孢子培養的效率。

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