一株產纖維素酶真菌的篩選和誘變

蔣瓊鳳 ，張金金 ，周 斌 ，謝達平 ，黃光文

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南科技學院生命科學與化學工程系，湖南 永州 425100）

纖維素是植物材料的主要成分，也是地球上最豐富的可再生資源，它曾被指望用于解決人類的食品、能量和環境問題，但目前這些生物量除了用于燃燒和造紙等以外很少有其它的用途[1]。將纖維素物質轉變為糖、乙醇、甲烷等容易利用的小分子有機物是國際上重大課題之一[2]。國內外科研工作者已先后篩選和培育了許多產纖維素酶的菌種，其中木霉屬菌株產生的纖維素酶活力較高。由于其粗酶制劑中含有較高活力的酶，因而成為當前生產上應用較多的菌種。但與淀粉酶和蛋白酶相比，其生產規模小，酶的活力也較低，酶解效率不高[3-4]。因此，篩選酶活力高且穩定的野生菌株，以及對篩選的菌株進行誘變處理提高其酶活力具有重要的現實意義。筆者擬從自然環境篩選具有較好產纖維素酶活力的野生菌株，誘變出酶活提高較大的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土 樣 菜地、造紙廠、枯木、竹林土、樹林樹葉土，牛糞、腐爛的谷殼和秸稈下的腐殖土，廢棄蘑菇培養基、苗圃土。

1.1.2 試 劑 0.1 mol/L、pH值 4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液：稱取檸檬酸21.014 g、檸檬酸鈉29.412 g溶于500 mL去離子水中，待溶解之后定容至1 000 mL，再用pH計調節其pH值至4.8。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）：稱取10 g CMCNa 溶于 500 mL、pH 4.8（0.1 mol/L）檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，待溶解之后用緩沖液定容至1 000 mL。DNS試劑的配制參考文獻[5]。

1.1.3 培養基 （1）篩選培養基。NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，CMC-Na 15 g，蒸餾水 1 L，pH 值 5.5～6.0，瓊脂 15～20 g，2%去氧膽酸鈉溶液 20 mL（預先滅菌，臨用前加入），鏈霉素溶液（10 000 U/mL）3.3 mL（臨用前加入）。（2）濾紙條培養基。參考文獻[6]并稍加改動：無機鹽液（KH2PO42 g，（NH4）2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnSO41.7 mg，CoCl21.7 mg，吐溫-80 1 mL，加蒸餾水定容到 1 L，pH 5.5～6.0。（3）固體發酵培養基。固體料（稻草粉∶麩皮∶豆粕粉∶玉米粉=4∶2∶2∶1），無機鹽液同濾紙條培養基，固料∶無機鹽液=1∶2.5。于250 mL的三角瓶中加入9 g固體料和22.5 mL上述無機鹽液并用玻璃棒攪拌均勻，加棉塞121℃滅菌1 h。

1.2 方法

1.2.1 稻草纖維素的制備及濾紙的預處理 制備與預處理參考文獻[7]進行。

1.2.2 菌種篩選 菌種初篩：菌種的分離純化[8]，待菌種純化后再將純種點種到初篩培養基于28℃培養4 d，用2 g/L的剛果紅染色30 min，再用適量的1 mol/L NaCl脫色30 min，測量菌落和水解圈的直徑并計算酶的相對比活力：A=水解圈直徑/菌落直徑。

菌種復篩：取斜面培養的孢子接入固體發酵三角瓶，28℃條件下培養2 d，扣瓶，發酵108 h左右取酶液測定其CMC酶活和FPA酶活。

1.2.3 酶液的制取 固體發酵培養基，向三角瓶固體曲加入一定量的雙蒸水（按干曲重量加水10 mL/g）于室溫、160 r/min振蕩1～2 h，用雙層紗布過濾，4 000 r/min離心15 min，上清液為粗酶液，適當稀釋后測定還原糖濃度。固曲的換算[9]：取鮮曲5 g于105℃烘干，測定其含水量。

1.2.4 酶活力的測定 （1）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）酶活力。以1%CMC-Na溶液為底物，在50℃，pH值4.8的條件下，1 h分解CMC-Na產生1 μmol葡萄糖所需的酶量，定義為一個CMC酶活單位，以U/g（干曲）表示。測定方法：取1%CMC-Na溶液2 mL于10 mL的離心管中，放入50℃水浴鍋中預熱5 min后加入0.5 mL適當稀釋的酶液，50℃恒溫酶解反應30 min；取0.5 mL反應后的酶液和1.5 mL DNS于試管，將試管沸水浴15 min，冷卻后加入10 mL去離子水，搖勻，于540 nm比色測定OD值。根據吸光度從葡萄糖標準曲線中查出相應的葡萄糖含量，根據生成的葡萄糖含量計算出CMC-Na酶活值。

（2）濾紙（FPA）酶活力。以濾紙為底物，在pH值4.8，50℃恒溫條件下，1 h分解濾紙產生1 μmol葡萄糖所需的酶量，定義為一個濾紙酶活單位，以U/g表示。測定方法：將定性濾紙（新華濾紙1 cm×6 cm）卷成小卷，放進10 mL的離心管中，加入檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH值 4.8）2 mL放入50℃水浴鍋中預熱5 min后，再加入1 mL適當稀釋的粗酶液，輕輕搖勻，使濾紙完全浸泡在液體中，50℃保溫1 h；然后取0.5 mL反應后的酶液和1.5 mL DNS于試管，將試管沸水浴15 min，冷卻后加入10 mL去離子水，搖勻，于540 nm比色測定OD值。根據吸光度從葡萄糖標準曲線中查出相應的葡萄糖含量，根據生成的葡萄糖含量計算出濾紙酶活值。

1.3 紫外誘變

制備好的孢子懸液在紫外燈20 W，照射距離24 cm條件下進行誘變，誘變時間分別為20～180 s（間隔為20 s）。到達照射時間后，用移液槍吸取0.1 mL并稀釋涂平板，每個照射時間的依次稀釋到104/mL、103/mL、102/mL 3個梯度，每個梯度吸取 0.1 mL涂平板。用黑色塑料袋包好，避光，29℃倒置培養。2～3 d后挑取長勢較好的單菌落接PDA斜面培養，以備進一步篩選。

1.4 誘變菌株的篩選

酶活等的測定方法與上述的菌株篩選同。

2 結果與分析

2.1 菌株的初篩

初篩過程中，在CMC-Na平板能夠長出明顯的菌落的真菌大多可以看到明顯的水解圈，但有的菌落雖然長勢較好，但沒有水解圈。測量其水解圈和菌落的直徑，結合二者比值及菌株的生長狀況選擇其中較好的16株真菌，分別進行劃線分離、編號并保藏于固體斜面培養基上，為下一步復篩做準備。

2.2 菌株的復篩

對初篩得到的16株真菌搖瓶復篩分別測出這些真菌的CMC酶活值和FPA酶活值并且觀察它們的濾紙崩解情況，最后得到了一株酶活力較高的菌株zzh7。

從 圖 1 中 可 以 看 出 ，zzh2、zzh3、zzh5、zzh7、zzh8、zzh11、zzh13、zzh14、zzh15 的 CMC 酶活值在16株真菌中較高，其中zzh5的最高，為3 134.54 U/g，zzh7為2 972.53 U/g。從圖2中可以看出，zzh2、zzh5、zzh7、zzh8、zzh14的 FPA 酶活值在 16株真菌中較高，其中zzh7的最高，為203.86 U/g，zzh5為128.33 U/g。從表1中看出，zzh7等11株濾紙崩解的較厲害，zzh4、zzh7、zzh10濾紙崩解為不定形。試驗結果表明，zzh7為酶活力較高的野生菌株。

圖1 不同真菌的CMC酶活力值

圖2 不同真菌的FPA酶活力值

表1 不同真菌的濾紙的崩解情況

2.3 紫外誘變結果分析

圖3和圖4所示，突變菌株z1～z5的各組酶活與出發菌株相比都有不同程度的提高。其中z1菌株酶活力的提高幅度最大，CMC-Na酶活力、FPA酶活力分別達3 554.88 U/g、506.76 U/g，比出發菌株相應提高1.19倍和2.48倍。其中FPA的提高最大，說明纖維素酶系中3種酶，即纖維二糖水解酶（C1）、葡聚糖內切酶（CMCase）和 β－葡萄糖苷酶（β-Glase）的協同作用增強了，意味著對纖維素的降解能力有較大程度的提高。由圖5、圖6可知，z1傳代后纖維素酶活力值高且穩定。

圖3 不同菌株的CMC酶活力值

圖4 不同菌株的FPA酶活力值

圖5 z1傳代的CMC酶活值

圖6 z1傳代的FPA酶活值

3 結論與討論

3.1 結論

通過CMC固體培養基培養，剛果紅染色、NaCl脫色，根據透明圈直徑和透明圈直徑與菌落直徑之比的大小及酶活測定，初篩出產纖維素酶活力較高的真菌16株。通過搖瓶發酵復篩，獲得了產纖維素酶活較高且酶活力穩定的真菌1株，命名為zzh7。在紫外照射160 s、致死率為87.2%條件下獲得的一株突變株z1，其CMC酶活力為3 554.88 U/g、FPA酶活力為506.76 U/g，較出發菌株分別提高了19.59%、148.58%。z1傳代后纖維素酶活力值高且穩定。

3.2 討論

3.2.1 菌株與酶活 我國目前纖維素酶生產的菌株，其 FPA 酶活僅為 100 μmol/g·h[10]。張建強[11]分離的脈紋孢菌（Neurospora sp.）FPA酶活為386.7 μmol/g·h，CMC 酶活為 3551.1 μmol/g·h。鄔敏辰[12]研究的綠色木霉的FPA酶活達到555 μmol/g·h。而筆者在篩選的zzh7的濾紙酶活值達到203.86 U/g、CMC酶活為2 972.53 U/g，經紫外誘變后的z1濾紙酶活值達到506.76 U/g、CMC酶活為3 554.88 U/g。zzh7和z1與張、鄔所研究的菌株相比較，z1的CMC酶活與張的相差很小，但FPA酶活卻明顯大于張，與鄔的FPA酶活相似。因此，筆者得到的這兩個菌株酶活比較高，屬于高酶活菌株。

3.2.2 水解圈與酶活 纖維素分解菌目前普遍采用的分離方法是剛果紅法[13]。一般情況下，纖維素剛果紅培養基用于識別產纖維素酶菌株和初步判定酶活性高低：產酶愈多，水解圈愈大；產酶越快，水解圈則出現越早[14]。但水解圈的大小并不是判斷菌株產纖維素酶活高低的唯一依據。筆者發現，在篩選的過程中有的菌落長勢較好但無水解圈，有的透明圈小但酶活大，這與姚強、馮健玲觀察到的現象一致[15－16]。其原因有很多方面，如固體和液體培養條件不同；不同菌株具有不同的生長和產酶速度以及不同的纖維素酶系；菌苔大小及其在平板上堆積情況的差異等，都會造成透明圈大小與液體發酵酶活結果的不完全一致[17-18]。

3.2.3 吐溫-80與酶產量 真菌產生的纖維素酶屬于胞外酶。胞外酶必須分泌到細胞外才能充分發揮作用，因此改變細胞膜的通透性能提高酶產量。表面活性劑能改變細胞膜的通透性提高酶的產量，但離子表面活性劑對細胞是有毒性的，而少量非離子表面活性劑可以提高酶的產量[19]。因此，吐溫-80可作為培養基添加物質來提高酶的產量。劉穎和許曉鵬的研究均表明，0.05%～0.1%的吐溫-80可顯著提高纖維素酶活力[20－21]。筆者根據出發菌株zzh7的生長特點選擇在培養液中添加0.1%吐溫-80，實驗表明能夠提高纖維素酶的產量。

3.2.4 菌種鑒定與培養條件優化 研究得到的菌株zzh7的菌落形態與18S rDNA的ITS序列數據支持其是一個新的菌種，此內容另文發表。

由于纖維素酶系是一類復雜的復合誘導酶，不同的底物對纖維素酶活力會有很大的影響[22]。大量研究證明，不同的碳源、氮源及不同的濃度都會對纖維素酶系中的各組分酶活有促進作用；不同的培養條件（pH值、溫度、濕度等）也會對其有較大的影響。筆者所使用的固體發酵培養基是根據相關文獻設計的，該培養基還有待完善。因此，zzh7及其誘變后菌株z1最佳產酶的基質組分和培養條件還有待進一步研究。確定該菌株最佳的產酶條件后，其纖維素酶活力有望進一步提高。

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