歐文氏桿菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表達

李 炫，彭克勤，劉正初

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410006）

甘露聚糖酶是一種重要的工程酶，能降解甘露聚糖、木質素等物質，在紡織、造紙、飼料、食品、石油開采等諸多領域都有重要用途[1]。該酶在對草本植物纖維提取中半纖維素的降解方面起著舉足輕重的作用[2]。中國農科院麻類研究所工程酶實驗室篩選到的歐文氏菌CXJZ95-198具有較高的甘露聚糖酶活性，張運雄等克隆到其甘露聚糖基因manA，分析發現manA基因的DNA序列與其他DNA序列同源性很低[3-4]。本研究構建了N端缺失片段的表達載體，初步研究了manA N端部分序列的功能，旨在為以后改造甘露聚糖酶基因提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 歐文氏桿菌CXJZ95-198，大腸桿菌E.coliBL21（DE3），載體pET 28 a由中國農業科學院麻類研究所工程酶實驗室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑BamHI、HindIII、T4連接 酶 、PCR Supermix、DNA mark III 等 均 購 自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及目的基因的PCR擴增 如表1所示，根據GenBank報道的甘露聚糖酶基因序列（DQ364440）設計了以下5個引物，均由上海生工合成。用PCR方法對CXJZ95-198全基因組DNA進行擴增，PCR反應參數為：94℃預變性3 min，94℃，變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 60 s，30 個循環，最后72℃ 延伸 10 min，冷卻至4℃。

1.2.2 manA及缺失片段突變體的獲得 將PCR擴增產物經電泳檢測、膠回收后，分別用BamHI和HindIII進行雙酶切，37℃酶切3 h，回收目的片段，連入pET 28 a載體。連接過夜體系如下：1 μL pET 28 a載體，5 μL 目的 DNA，1 μL T4 DNA 連接酶，3 μL dd H2O。連接產物通過42℃熱激轉化至E.coliBL21（DE3）感受態細胞里，37℃ 恢復培養1 h后涂于含50 μg/mL卡那霉素的選擇性LB平板上，倒置37℃培養過夜。

表1 引物設計

1.2.3 表達載體的鑒定 用BamHI和HindIII對重組質粒進行雙酶切，37℃反應3 h，電泳檢測酶切。

1.2.4 表達載體在大腸桿菌里的表達與甘露聚糖酶活性的鑒定 挑取陽性克隆子接種于含卡那霉素的LB培養液中，37℃培養5 h，點種于甘露聚糖酶篩選平板上，37℃培養過夜，觀察透明圈產生情況。

1.2.5 重組子表達產物SDS-PAGE分析 對重組子表達產物進行SDS-PAGE分析，參照文獻[5]進行。

2 結果與分析

2.1 缺失表達載體的構建

質粒在酶切以前是閉環拓撲結構，無法被凝膠電泳反映其真實大小，但被限制性內切酶切成線性形狀后，它的長度可以在電泳圖中反映出來，圖1是pET 28 a在BamHI和HindIII雙酶切后的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，條帶大小約是5 000 bp左右，與pET 28 a質粒的實際大小5 361 bp相符。

以CXJZ95-198基因組為模板，如表2所示，按目的片段 pF1（F1/R1）、pF2（F2/R1）、pF3（F3/R1）、pF4（F4/R1）加入相應的正反引物進行擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2），結果表明目的片段擴增特異性很好，濃度合適。

表2 擴增缺失片段的對應引物以及擴增產物大小

2.2 缺失表達載體的質粒酶切鑒定結果

分別提取能在含有卡那霉素的LB培養平板中生長的pF1-pF4轉化子的質粒，5 μL質粒加入BamHI和HindIII 37℃保溫2 h后用凝膠電泳驗證。如圖3所示，1～4泳道中4 500 bp以上的條帶是大小為5 000 bp左右的pET 28 a質粒，1 200～800 bp之間呈梯度排列的條帶是pF1-pF4 DNA片段，說明所挑取的轉化子為陽性轉化子。

2.3 重組子的甘露聚糖酶活性活性鑒定

挑取pF1-pF4轉化子的典型菌落點在甘露聚糖酶篩選培養基上，37℃培養過夜，觀察各轉化子在甘露聚糖篩選培養基上所表現的透明圈可初步判斷該轉化子的產酶情況。如圖4所示，陽性對照歐文氏桿菌CXJZ95-198產酶能力很高，生成的水解圈比其他各缺失表達體系都大，說明該酶在大腸桿菌高效表達體系中優勢不明顯。陰性對照大腸桿菌E.coliBL21（DE）不分泌甘露聚糖酶，不產生透明圈。4個缺失表達體系橫向對比，pF1透明圈最大，pF2和pF3酶活性較pF1大幅下降，pF4沒有甘露聚糖酶活性，pF1和pF2橫向對比說明缺失了的信號肽序列對酶活或者酶的分泌能力有負面影響，pF2和pF3透明圈大小無明顯差異說明N端信號肽后10個AA對該酶的活性無影響，可刪除。pF4和pF3比較說明pF4多刪除的10個AA對該酶的活性有非常重要的影響。

2.4 重組子表達產物的SDS-PAGE分析

分別挑取pF1-pF4四種菌的陽性克隆子的單菌落，在5 mL含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中37℃，180 r/min震蕩培養6 h，再將活化菌按2%的比例接種100 mL含有同樣濃度的卡那霉素LB培養基中擴大培養，OD600=0.6時加入0.8 mM的IPTG誘導表達，20 h后分別收集菌體跑SDS-PAGE電泳。

如圖5所示，在45 kD左右能很清晰地看到很明顯的蛋白條帶，比其他條帶濃很多，大小與預測的大小相符，可以認為是目的蛋白帶，pF1-pF4的蛋白帶由大到小成成的梯度反應了依次缺失的序列所翻譯的蛋白質大小依次縮小。與目的期望相符，pF1強表達兩條帶，大小相差不多，除了預測在45 kD以上的那條帶以外在小于45 kD的地方也強表達一條帶，從氨基酸序列信號肽預測得知manA N端前27個AA為信號肽序列，pF1包含了信號肽序列，pF2-pF4都缺失了信號肽序列，所以pF1的胞內蛋白存在分泌途徑已切除信號肽和未切除信號肽，有兩條帶，其他重組子胞內表達產物只有一條帶。

3 結論

本研究成功構建了4種不同的表達載體，分別是pF1（manA全長），pF2（N端27個AA缺失），pF3（N端37個AA缺失），pF4（N端47個AA缺失）。用甘露聚糖酶篩選培養基檢測發現，pF4不表現出甘露聚糖酶活性，pF3，pF2都表現出較弱酶活性，pF1酶活性最高，但也低于原始菌CXJZ95-198，表明ManA N端37-47個AA可能對該酶結構或活性有重要影響。N端27-37個AA缺失對該酶無明顯影響，N端信號肽缺失對該酶的分泌有較大負面影響。在對蛋白SDS-PAGE膠進行研究時發現pF1表達兩條帶，大小相差不多，除了預測在45 kD以上的那條帶以外在小于45 kD的地方也強表達一條帶，胞外分泌蛋白重量最大的pF1卻比pF2，pF3，pF4的蛋白條帶小，甚至小于45 kD。推測因為pF1包含了信號肽序列，pF2－pF 4都缺失了信號肽序列，所以pF1的胞內蛋白存在分泌途徑已切除信號肽和未切除信號肽，有兩條帶。胞外分泌蛋白只表示切除信號肽分泌到胞外的，所以只有一條帶。

[1]吳 襟.微生物 β-甘露聚糖酶 [J].微生物通報，1999，26（2）:134-136.

[2]劉正初.麻類纖維提取工程微生物研究回顧與展望[J].中國農業科學，2007，40（增刊）：1363-367.

[3]yunxiong Z，zhengchu L，Xinbo C.Cloning and expression of a mannanase gene from Erwinia carotovora CXJZ95-198[J].Annals of microbiology，2007，57（4）：623-628.

[4]張運雄.麻類生物脫膠與生物制漿酶系[J].中國麻作，2003，24（2）：14-17.

[5]張龍翔，張廷方，李令媛.生化試驗方法與技術 [M].北京:高等教育出版社，1997.