一種篩選染料脫色真菌的新方法——脫色圈法

魏寶陽，賀龍澤，龔思齊，李金龍

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128；2.長郡中學，湖南長沙410000；3.湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙410128）

據國家環保總局對我國水環境污染現狀的統計與調查，我國的江河、湖泊及近海流域已普遍受到不同程度的污染，造成污染加重的主要因素是工業廢水和生活污水的排放，水污染已經成為嚴重的社會問題[1]。紡織印染工業是現代工業中對環境造成嚴重污染的產業之一[2]。據不完全統計，紡織印染業廢水排放量居全國工業行業第5位，其廢水排放總量為14.13億t，每年占全國工業廢水統計排放量7.5%[3]。印染廢水具有水量大、有機污染物含量高、堿度高、色度高、生物降解難、水質變化大等特點，屬難處理的工業廢水之一[4]，印染廢水的脫色處理成為了印染廢水治理的關鍵環節[5-6]。研究表明，對印染廢水起脫色作用的微生物主要有真菌、細菌和藻類3種。近年來，有脫色能力的微生物被廣泛發現并利用[7]，如細菌中的假單胞桿菌（Pseudomonas），藻類中的普通小球藻（Chlorella valgaris）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），真菌中的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等[5]。為此，筆者設計了一種從土壤中分離篩選印染廢水處理用微生物的新方法——脫色圈法，旨在篩選對染料有明顯脫色能力的真菌，為處理印染廢水提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤來源：造紙廢水和生活污水等排入瀏陽河的主入口處河岸的土壤。

1.2 試驗儀器

TOMY自動立式滅菌鍋 SS-323（TOMY KDGYOCO.,LTD），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），MJX-160型霉菌培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），SYC-L1型恒溫搖床（上海聯環生物工程設備有限公司），WF J 7200型可見光分光光度計[尤尼科（上海）儀器有限公司]，UV－2100雙光束紫外可見光分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司），DHG-9070型電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），D2F-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），OLYMPUS BX41TF熒光顯微鏡（OLYMPUS CORPORATION TOKYO,JAPAN）。

1.3 培養基的配制

培養基的配制方法參考沈萍等[8]，選用改良馬丁氏培養基：葡萄糖10 g/L，NH4NO32 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，固體培養基加入瓊脂20 g/L，pH自然，TOMY自動立式滅菌鍋 121℃、20 min滅菌，自然冷卻至室溫備用。

染料-改良馬丁氏培養基：改良馬丁氏培養基消毒滅菌、冷卻至適溫（65～75℃），加入經過濾滅菌處理的一定濃度的孟加拉紅、亞甲基藍、藏花紅、結晶紫、孔雀綠。

染料-PDA培養基：PDA培養基消毒滅菌，冷卻至適溫，分別加入滅菌處理的一定濃度的孟加拉紅、結晶紫、藏花紅、伊紅丫橙、孔雀綠和亞甲基藍。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤微生物的分離與篩選 采用常規的“10倍稀釋法”：用無菌紙稱取土樣10 g，放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的250 mL三角瓶中，振搖30 min、靜置30 min，獲得土壤懸液。用1 mL移液管吸取1 mL土壤懸液，注入盛有9 mL無菌水的試管中，充分混勻，得到第一個稀釋液（10-1）；然后，另取一只1 mL移液管吸取1 mL第一稀釋液，注入另一盛有9 mL無菌水的試管中，搖勻，得第二稀釋液（10-2），依此類推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。以上所用三角瓶、試管及1 mL移液管均已滅菌處理。分別取10-4、10-5、10-63個稀釋度的土壤懸液0.1 mL，涂布于含0.3%的孟加拉紅-改良馬丁氏培養基平板（每個稀釋度設3個重復），培養皿倒置，30℃培養48 h，對平板培養基上菌落進行初步分離、篩選，得到單菌株。

篩選具有脫色圈的菌落，脫色能力的強弱可以通過以下公式做初步判斷：Hc=R1/R2，其中R1為脫色透明圈的直徑，R2為菌落的直徑，Hc越大的菌初步認為脫色能力越強。

1.4.2 黑曲霉固體培養條件下的脫色能力測試接種環點接斜面菌種于染料-PDA培養基平板中央，30℃培養72 h。染料有孟加拉紅、結晶紫、藏花紅、伊紅丫橙、孔雀綠和亞甲基藍，每種染料3次重復。

1.4.3 黑曲霉液體培養條件下的脫色能力測試染料—馬丁氏液體培養基接種0.1 mL孢子懸浮液，150 r/min，30℃振蕩培養48 h。其中染料分別為孟加拉紅、亞甲基藍、藏花紅、結晶紫、孔雀綠，每種染料3次重復。稱量菌體干重，并對脫色后的溶液用可見光分光光度計測出最大吸收波長處的OD值，以不接種菌體的染料溶液初始OD值為對照，計算脫色率。以脫色率表示菌株對染料的脫色能力[10]。

脫色率=（A-B）/A×100%（A：脫色前染料在最大吸收波長處的OD值；B：脫色后染料溶液在最大吸收波長處的OD值。）

2 結果與分析

2.1 菌種分離、篩選及鑒定

將 10-4、10-5、10-63個稀釋度的土壤懸液，分別涂布于孟加拉紅-改良馬丁氏培養基平板，30℃培養48 h后，平板中有的菌落周圍出現了脫色后的透明圈，說明這些菌落可能對染料有脫色作用。對這些菌落進行初步分離篩選得到單菌株（見圖1）；其后，挑取少量菌株，純化后接入斜面保藏培養基（改良馬丁氏培養基），30℃培養、擴繁保存，供后續試驗使用（見圖2）。

圖1 脫色菌初篩結果

圖2 純化后菌落脫色圈

根據葉世泰等[11]提供的形態指標，初步鑒定該菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）；經孟加拉紅-改良馬丁氏培養基平板的初步檢測，黑曲霉菌株生存能力較強，適應抑菌能力較強的色素培養基環境，推測其具有較強的脫色能力。

2.2 黑曲霉固體培養條件下的脫色能力

培養72 h后，各平板出現了不同程度的脫色和抑菌現象，具體見表1。

表1 脫色譜初步測試結果

抑制菌體生長中，結晶紫與伊紅丫橙接近，72 h后抑菌率均為78.6%；而孔雀綠培養基的抑菌率高達為97.1%。72 h后，孟加拉紅、藏花紅和亞甲基藍的脫色圈很明顯。由此可知，不同的色素對菌體的毒害作用不同，除部分色素對該菌有較強的抑制作用外，色素的毒害作用不大；且黑曲霉的脫色譜較廣，在色素培養基中的適應能力也較強，說明該菌有一定的應用價值。

2.3 黑曲霉液體培養條件下的脫色能力

孟加拉紅、亞甲基藍、藏花紅和結晶紫等染料—馬丁氏液體培養基培養96 h后，分別于546、664和560 nm下測量濾液的OD值，并計算脫色率，結果見圖3。

在染料—馬丁氏液體培養基培養條件下，黑曲霉對不同色素的脫色能力差異顯著，對孟加拉紅和結晶紫的脫色能力很強，達93.93%，藏花紅僅為30.26%，亞甲基藍為57.68%，而菌體的干重均為0.17 g。雖然液體培養條件和固體培養條件有一定的差異，但總體上差別不顯著，這表明可以用固體培養的方法做脫色菌的初篩方法，再通過液體發酵的復篩，找到有潛力的脫色菌株。

3 討論

孟加拉紅（又名虎紅鈉鹽，分子式為C20H2Cl4I4Na2O5，結構式見圖4）既是一種染料（染料索引號為C.I.45440），也是一種在真菌分離中廣泛應用的細菌和放線菌的抑菌劑；孟加拉紅分子中既含有氧蒽結構又具有三苯烷結構，表明能降解孟加拉紅的生物可能具有廣泛的染料降解譜[9]；因此，選用孟加拉紅作為菌種脫色處理用染料。

用紫外分光光度計對孟加拉紅染料進行全波長掃描（200～800 nm），確認其在可見光范圍內的最大吸光度的波長為546 nm（圖5），測定所得的OD值以OD546表示，以此來檢測所篩真菌的脫色效果。

以脫色圈法篩選有脫色能力的真菌，不需要特殊的試劑，方法簡單、費用較低，篩選出的真菌菌體能分泌降解色素的物質或富集培養基里的色素。該方法可以作為篩選其他脫色能力的微生物的常用方法。

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