冷卻豬肉中假單胞菌生長預測模型的建立與驗證

唐曉陽，趙 勇，孫曉紅，吳啟華，潘迎捷

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.美國緬因大學食品科學與人類營養系，緬因州04469-5735）

假單胞菌通常被認為是引起冷卻肉腐敗的主要微生物[1-2]，因此研究假單胞菌的生長預測模型對冷卻豬肉貨架期和安全性的預測與監控具有重要意義。傳統的微生物檢測不僅耗時耗力，而且結果具有滯后性，起不到預測的作用[3]。采用數學模型預測微生物的生長可以及時有效地預報微生物的生長情況，從而預測肉品的安全性和貨架期。筆者選用分離自腐敗冷卻豬肉的6株假單胞菌的混合培養液，研究了假單胞菌在0～10℃下的生長情況，建立生長預測模型，試圖實現對0～10℃冷藏條件下假單胞菌的生長進行快速預測，為建立冷卻豬肉的貨架期預測模型提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試的假單胞菌 P1，P2，P3，P4，P5，P6 均分離自腐敗豬肉，P1和P2為惡臭假單胞菌，P3和P4為熒光假單胞菌，P5和P6為莓實假單胞菌。

1.2 菌種活化

將6株菌分別從4℃保存的斜面轉接至胰胨大豆胨瓊脂（TSA）斜面，經30℃，24 h培養活化后，從此斜面挑取一環培養物轉接至胰胨大豆胨瓊脂肉湯（TSB）培養基中，放入搖床，30℃，180 r/min，培養18 h，將6種菌的培養物等比例混合，以此混合菌液為初始接種物。

1.3 菌培養物的制備

計數培養基為TSA，生長培養基為TSB，均購于上海中科昆蟲生物技術開發有限公司。向每個18 cm×180 cm的試管中準確加入9.9 mL TSB培養基，121℃下滅菌20 min，備用。將上述初始接種物進行一定的梯度稀釋后，按100μL的接種量接種至含有9.9 mL TSB培養基的試管中，使10 mL TSB的初始菌數大約為103～104CFU/mL。并將試管分別放于 0、2、4、7、10℃溫度下培養，每隔一天取出一支試管，用平板計數法測定菌落總數[4]。

取樣過程應在盡量短的時間內完成，以減少溫度波動對試驗結果的影響。

1.4 一級模型的擬合

一級模型的擬合運用Origin軟件（Version 7.5），比較線性模型和修正的Gompertz模型擬合不同溫度下假單胞菌的生長曲線，比較這兩種模型的擬合效果，得出擬合效果更好的模型及其相應的一級模型參數，建立0～10℃下假單胞菌的一級模型。線性模型的表達式為：

式中Nt為微生物在時間T時的對數值（lg CFU/mL）；A為隨時間無限減小時的漸進對數值（相當于初始菌數，lg CFU/mL）；k 為生長速率（h-1）。

修正的Gomperts模型[5]是雙指數函數，表達式為：

式中t為時間（h），Nt為t時的菌數，A為初始菌數N0（lg CFU/mL），C為最大菌數Nmax與初始菌數N0的差值（lg CFU/mL），B為在時間點M時的相對最大生長速率（h-1），M即是達到相對最大生長速率所需的時間（h）。由此可以得出 U（h-1）和 LPD（h）的計算公式如下：

其中e=2.718 2

U為微生物生長的最大比生長速率（h-1），LPD為微生物生長的延滯期（h），MPD為微生物的最大細胞密度（lg CFU/mL）。

1.5 二級模型的擬合

二級模型的擬合同樣運用Origin軟件（Version 7.5）對實驗數據進行線性回歸，應用平方根模型及Arrhenius模型擬合溫度-生長速率平方根曲線，研究溫度對于一級模型參數的影響。

1.5.1 平方根模型擬合 平方根模型[6]是用來描述環境因子影響常用的模型，簡單的表達式為：

其中aμ[（h0.5℃）-1]為U線性回歸的斜率；Tmin是一個假設的概念，理論上是指微生物生長沒有代謝活動時的溫度（℃）。以上模型的適用范圍是在[Tmin，Topt]，其中Topt是微生物生長的最適溫度。將一級模型求得的U和對應的溫度帶入方程（3）即可得出aμ 和 Tmin。

1.5.2 Arrhenius模型擬合 Arrhenius模型[7]也是常被應用于描述溫度對微生物的生長速率的影響的模型，方程式如下：

其中Aμ（h-1）為前指數因子，其作用是使模型能夠擬合最大比生長速率的值；Ea為微生物生長的活化能（kJ/mol）；R 是氣體常數（8.314 J/mol×K）；T為絕對溫度（K）。運用Origin軟件（Version 7.5）擬合實驗數據，將一級模型求得的U和對應的溫度帶入方程（3）即可得出 Aμ和 Ea。

1.6 模型的驗證

根據二級模型得出不同溫度下的預測值為Upredicted，通過實驗得到的數據為Uobserved，n為測定次數。計算偏差因子（bias factor）和準確因子（accuracy factor）是用來表明模型的預測值與實驗實測值之間的接近程度，并以此驗證所建模型的準確性。偏差因子和準確因子的表達式如下：

2 結果與分析

2.1 假單胞菌在不同冷藏溫度下的動力學模型

采用線性模型、修正的Gompertz模型擬合0～10℃下假單胞菌的生長曲線所得統計結果如表1所示。

從多重判定系數R2來看，在0～10℃范圍內，僅0℃時，線性模型的R2為0.975 0，隨著溫度的升高，線性模型的R2值隨之下降，到10℃時僅為0.675 7，由此可見，線性模型只適合模擬低溫下（如0℃，2℃）假單胞菌的生長情況，使用范圍有限。而在較高的環境溫度下，線性模型已不能準確地模擬假單胞菌的生長情況。修正的Gompertz模型常被用于模擬食品中微生物的生長[8-9]。從表1可以看出，在0～10℃范圍內，修正的Gompertz模型的R2均在0.96以上，擬合效果良好。

表1 假單胞菌生長曲線的統計分析R2值

圖1表示的是0～10℃下修正的Gompertz對假單胞菌生長數據的擬合曲線。從圖中可以看出，溫度對假單胞菌的生長有明顯的影響。當溫度為0、2、4℃時，擬合曲線不呈典型的S型，而在7℃和10℃時，擬合曲線呈典型的S型曲線。并且0、2、4℃時的最大菌數要小于7℃和10℃時的情況，由此可推測，溫度對于假單胞菌的最大菌數有一定的影響。

圖1 假單胞菌P1在不同溫度下修正的Gompertz模型擬合曲線

修正的Gompertz模型擬合假單胞菌生長曲線所得模型參數及特定生長參數如表2所示。從表2可知，隨著溫度的升高，假單胞菌的最大比生長速率也隨之升高，當溫度從0℃升高至10℃時，最大比生長速率由 0.028 4（h-1）升高到 0.126（h-1），增加了近5倍。由此可見，即使在冷藏溫度下，如果超過4℃，假單胞菌的生長速率也會顯著增加，從而導致食品的腐敗變質加速。由此可見，在實際的生產流通過程中，環境溫度一直保持在4℃以下，能更有效地延長食品的貨架期，提高食品的安全性。

而溫度對于微生物延滯期的影響，有相關文獻表明[10]，延滯期隨著溫度升高而縮短。然而本文中延滯期的變化并不是很明顯，可能是因為在0～10℃這個低溫范圍內，溫度的升高對延滯期的影響不大。在2、4和7℃時延滯期出現了負值，這可能是由于生長前期的數據采集不夠所致，應適當增加前期的取樣次數，確保采集足夠的實驗數據進行建模。

由表2的模型參數值得出0～10℃下假單胞菌的一級模型分別為：

0℃時，Nt=3.878+4.398×exp{-exp[-0.017 6×（t-62.877）]}；

2℃時，Nt=3.557+5.135×exp{-exp[-0.019 6×（t-25.003）]}；

4℃時，Nt=3.438+4.946×exp{-exp[-0.026 3×（t-25.506）]}；

表2 假單胞菌修正的Gompertz模型參數表

7℃時，Nt=2.63+6.227×exp{-exp[-0.027 9×（t-14.496）]}；

10℃時，Nt=4.227+4.435×exp{-exp[-0.077×（t-19.967）]}。

2.2 溫度對假單胞菌最大比生長速率的影響

修正的Gompertz模型能很好地預測0，2，4，7，10℃溫度條件下假單胞菌的生長，但無法描述溫度的變化對假單胞菌生長的影響。平方根模型和Arrhenius模型因其使用簡單方便，常被用于描述溫度與微生物特定動力學參數之間的關系。

2.2.1 平方根模型擬合 根據表2所示假單胞菌在0～10℃下的最大比生長速率，運用Origin軟件（Version 7.5），采用線性回歸擬合最大比生長速率-溫度（-T），表明溫度與假單胞菌的最大比生長速率呈現良好的線性關系。

2.2.2 Arrhenius模型擬合 根據表2所示假單胞菌在0～10℃下的最大比生長速率，運用軟件（Version 7.5），采用線性回歸擬合最大比生長速率-溫度（InU-1/T），部分統計分析結果如表3所示。

從模型的方差分析來看，模型的總體顯著，表明平方根模型能較好擬合0～10℃冷藏條件下假單胞菌的最大比生長速率。由圖2和圖3的擬合結果可知，Arrhenius模型的R2為0.971 6，高于平方根模型的R20.932 6，則選擇Arrhenius模型為假單胞菌的二級預測模型。

圖2 假單胞菌的最大比生長速率與溫度間的平方根模型及其90%和95%置信區間

圖3 假單胞菌的最大比生長速率與溫度間的Arrhenius模型及其90%和95%置信區間

部分統計分析結果如表3，從模型的方差分析結果來看，模型的總體是顯著的，表明Arrhenius模型能夠較好地擬合不同溫度下假單胞菌的最大比生長速率。絕對溫度的倒數（1/T）與假單胞菌的最大比生長速率的自然對數呈良好的線性關系，lnU-1/T曲線見圖3。

表3 假單胞菌P1的二級模型統計分析結果

從圖上可以看出，二級模型的預測值都在此預測曲線的95%置信區間內，模型的預測結果可信。經過F檢驗，方程顯著，表明此方程能較好地描述該溫度范圍內假單胞菌的最大比生長速率與溫度之間的關系。所建二級模型如下：

InU=36.579-（91.422/0.008 314 T）），

T∈[273.15，283.15]

2.3 模型的驗證

通過Origin 7.5軟件求得各個溫度下U的預測值（Upredicted）實測值（Uobserved），并通過計算偏差因子和準確因子來判斷二級模型對最大比生長速率的預測效果。越接近于1表示模型的預測效果越好。一般認為偏差因子在0.75～1.25之間，準確因子一般在1.1～1.9之間[11]，模型即可被接受。筆者所建立的Arrhenius模型的偏差因子和準確因子分別為1.001和1.026，均接近于1，表明此模型能較好地預測0～10℃內實驗室培養條件下假單胞菌的最大比生長速率。

3 結論與討論

基于實驗室的前期研究，購置于超市的冷卻肉的初始菌量大多為103～104CFU/mL，選用103～104CFU/mL為液體培養基中的初始接種量。在實際中，由于樣品來源不同，所經歷的溫度等條件不同將會導致初始菌數的不同，初始菌量不同也對食品的貨架期和安全性產生影響，因此，可以進一步研究不同初始接種量下微生物的生長情況。

國內文獻報道多采用平方根模型[12]建立二級模型，而沒有采用其他二級模型與平方根模型進行比較。研究結果表明，Arrhenius模型的擬合效果優于平方根模型。在今后的研究中，可更多地應用Arrhenius模型來建立二級模型。

針對分離自腐敗豬肉的6株假單胞菌的混合培養液進行建模，所建立的二級模型為InU=36.579-（91.422/0.008 314 T）），T∈[273.15，283.15]。然而，由于冷卻豬肉中有多種不同的腐敗菌和致病菌。在生產、流通、銷售、貯藏各環節中，若溫度控制不當，可能引起假單胞菌的大量繁殖。目前的研究主要集中于針對一株假單胞菌的生長數據來進行建模，然而實際冷卻豬肉中的腐敗假單胞菌主要有熒光、惡臭和莓實假單胞菌，筆者采用6株假單胞菌的混合培養物作為受試菌液，所得的生長模型更加符合實際情況，進一步為冷卻豬肉的貨架期預測模型的開發打下了基礎。在建模過程中，如能考慮多菌種的混合培養，如假單胞菌與其他病原菌或與其他的腐敗菌進行混合培養來模擬實際冷卻肉品中微生物的生長情況，所建模型將更有實際意義。

常用的曲線擬合軟件如SAS，Statistica，MATA LAB等軟件功能強大，但需要編程，給使用者增添了一定了困難。運用Origin軟件（Version7.5），對0～10℃下假單胞菌的生長數據進行擬合。Origi軟件（Version 7.5）能自動生成擬合曲線，不需要編程和進行初始值的設定，使用更簡便，可為模型數據庫的建立提供方便。

致謝：特別感謝上海海洋大學朱雯娟、黃婧、項峰峰、成殷同學在試驗上的幫助。

[1]Gill C O,Newton K G.The development of aerobic spoilage on meat stored at chill temperatures[J].Journal of Applied Bacteriology,1977,43:189-195.

[2]Newton K G,Gill C O.The development of anaerobic spoilage flora of meat stored at chill temperature [J].Journal of Applied Bacteriology,1978,44:91-95.

[3]Mcdonald K,Sun D W.Predictive food microbiology for the meat industry:a review[J].International Journal of Food Microbiology,1999,52:1-27

[4]中華人民共和國國家技術監督局，GB4789.2-2003，食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定[S].北京：中國標準出版社，2004.

[5]Gibson A M,Bratchell N,Roberts T A.The effect of sodium chloride and temperature on the rate and extend of growth of Clostridium botulinum typeA in pasteurized pok slurry[J].Journal of Applied Bacteriology,1987,62:479-490.

[6]Ratkowsky D A,Olley J,McMeekin TA,et al.Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures[J].Journal of Bacteriology,1982,149:1-5.

[7]Koutsoumanis K,Nychas G J E.Application of a systematic experimental procedure to develop a microbial model for rapid fish shelf life predictions[J].International Journal of Food Microbiology,2000,60:171-84.

[8]Gibson A M,Bratchell N,Roberts T A.Predicting microbial growth:growth reponses of salmonellae in a laboratory medium as affected by pH,sodium chloride and storage temperature[J].International Journal of Food Microbiology,1988,6(2),155-178.

[9]McClure P J,Beaumont A L,Sutherland J P,et al.Predictive modeling of growth of Listeria monocytogenes[J].International Journal of Food Microbiology,1997,34:221-232.

[10]Augustin J C,Carlier V.Mathematical modeling the growth rate and lag time for Listeria monocytogenes[J].International Journal of Food Microbiology,2000,56:29-51.

[11]李 敏，李 耘，韓北忠.金華火腿中雜色曲霉的生長預測模型[M].食品與發酵工業，2005（11）：56-59.

[12]許 鐘，肖琳琳，楊憲時.羅非魚特定腐敗菌生長動力學模型和貨架期預測[J].水產學報，2005，29（4）：540-546.