五倍子、烏梅等45種中草藥提取物對鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用研究

邱慶連 ，潘清清，2，張友平，3，劉 問，錢 冬*

（1.浙江省淡水水產研究所，浙江湖州 313000；2.浙江省三門縣海洋與漁業局，浙江三門 317100；3.浙江省紹興縣農業局，浙江紹興 312000）

弧菌是海水養殖的主要病原菌，可引起海水養殖魚類、蝦蟹和貝類的多種疾病[1,2]，給海水養殖造成了極大的經濟損失。目前對于弧菌病的控制，還是采用以抗生素為主的化學藥物治療方法，抗生素的使用造成了嚴重的菌株耐藥問題，環境耐藥菌株的產生對人類健康造成了潛在的危害[3,4]。中草藥具有無抗藥性和藥物殘留、副作用小等優點，加上中草藥資源豐富，近年來在水生動物病害控制方面日益受到人們的關注[5,6]。某些中草藥還有促進機體生理代謝，提高機體抗病能力等作用[7]。

鋸緣青蟹俗稱青蟹，是浙江省重要的海水養殖蟹類。浙江省青蟹養殖年產量達到近3萬t，占全國總產量1/3。近年來，沿海養殖鋸緣青蟹長期受到病害的威脅。2006年青蟹全國平均發病率為13.77%，死亡率5.43%，全國青蟹因病害造成經濟損失達2億余元[8]。研究表明，弧菌是鋸緣青蟹較為常見的分離菌株[9,10]，也是青蟹重要的繼發病原，是引起青蟹養殖死亡的重要原因之一。作者從三門發病青蟹中也分離到較多的菌株，部分菌株對青蟹有較強的致病力。為從中草藥來源中尋找可能的抗菌活性組份，減少抗生素等化學藥物的使用，作者研究了45種常用中草藥提取物對鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

擬態弧菌Vibrio mimicus SM060818、梅氏弧菌V.metschnikovii SM060813、霍利斯弧菌V.hollisae SM060913為本實驗室分離自浙江三門發病鋸緣青蟹。

1.2 試驗儀器、藥物和試劑

試驗用離心機為Sigma 3K-15；藥物稱量精密電子天平為賽多利斯產品；細菌培養箱為上海精宏產品，細菌培養搖床為江蘇太倉，高壓滅菌鍋為上海博迅公司產品。

試驗用五倍子、川芎等45種中藥購自湖州市慕韓齋藥堂，用中藥粉碎機充分粉碎后陰涼干燥處保存備。

抑菌試驗用空白藥敏濾紙片及營養肉湯和營養瓊脂購自杭州天和生物技術有限公司，培養基使用時添加1%NaCl，均高壓滅菌備用。

1.3 中草藥的制備

1.3.1 藥物水提取法[11]

取粉碎中藥5 g，加水至75 mL，4℃浸泡12 h后，煮沸后用文火煎煮30 min，濾出煎液，再加相同體積的水煎煮。合并3次煎煮液，加熱濃縮至7 mL，12 000 r/min離心10 min，取上清4℃保存備用。

1.3.2 藥物醇提取法

取粉碎中藥1 g，加5 mL 95%乙醇，浸泡，60℃水浴1 h，取上清4℃保存備用。

1.4 中草藥提取物的藥敏紙片制備[12]

分別取水提取法和醇提取法制備的藥液上清，取20 μL滴加于直徑6 mm的空白紙片上，50℃充分烘干備用。

1.5 中草藥提取物的抑菌測定

采用紙片擴散法（K-B法）進行[13]，實驗菌株經添加1%NaCl的營養肉湯培養振蕩培養28℃18 h后，取菌液100 μL加至1%NaCl的營養瓊脂平板上，用三角玻棒均勻涂布；將制備好的中草藥提取物藥敏紙片貼于涂布好菌液平板，28℃恒溫培養24～48 h；測量并記錄抑菌圈直徑。

1.6 中草藥提取物的最小抑菌濃度（MIC）測定

試驗在添加1%NaCl的營養肉湯中進行，方法參照文獻[11]試管2倍稀釋法，本文采用96孔微量2倍稀釋法測定進行:各個待測藥物設10個稀釋度,每個濃度設3個重復；每個培養孔中加入125 μL含不同濃度藥物的培養液，隨后加入稀釋菌液25 μL濃度為6×106CFU/mL試驗菌液，使最終菌濃度達到1×106CFU/mL；28℃恒溫培養24 h，觀察結果，以完全抑制待測菌生長的最低藥物濃度作為最低抑菌濃度（MIC）。

待測中草藥提取物的藥物濃度采用干燥稱重法確定，準確量取1.00 mL中草藥提取物，加至1.5 mL離心管中，80℃烘箱烘干，稱干重。

2 結果

2.1 中草藥提取物對擬態弧菌抑菌活性

采用瓊脂平板紙片擴散法（K-B法）對45種中草藥提取物對青蟹分離菌進行的抑菌活性進行了體外檢測，結果發現五倍子、烏梅、艾葉、天冬、秦皮、虎杖、知母等28種中草藥提取物都有一定的抑菌效果；千里光、穿心蓮等17種中藥提取物對分離菌株無抑制作用。分析水提取法和醇提取法成份的抑菌活性，發現大部分中草藥在2種提取液中都可存在抑菌活性成份，以水提取法的活性高于醇提取法；青蒿的水提取物對擬態弧菌SM060818無明顯的抑菌活性，而醇提取物存在較強的抑菌活性（表1）。

表1 45種中草藥提取物對擬態弧菌的抑菌作用Tab.1 Antibacterial effect of 45 Chinese herbs extractions to Vibrio minicus

2.2 中草藥提取物對3種青蟹分離弧菌的抑菌活性

分析28種中草藥提取物對3種青蟹分離弧菌的抑菌活性，結果表明：五倍子、烏梅、秦皮、艾葉等提取物抑菌作用較好，對3種分離菌株均有較好的抑菌效果；天冬、白頭翁、赤芍、金銀花、黃精、黃柏、青蒿等中草藥僅對其中1～2個菌株有抑制作用(表2)。同時還發現，擬態弧菌分離株SM060818對各類中藥提取物的抑菌靈敏度更好，霍利斯弧菌分離株SM060913相對不敏感，而梅氏弧菌的分離株SM060813則相對耐藥。表2為抑菌活性較強的22種中藥對3種弧菌分離株的抑菌試驗結果。

表2 中草藥提取物對3種青蟹分離弧菌的抑菌活性Tab.2 Antibacterial effect of Chinese herb extractions to Vibrio isolates from Scylla serrata

2.3 中草藥提取物對青蟹致病弧菌的最小抑菌濃度（MIC）

從紙片擴散試驗中選取有較好抑菌效果的9種中草藥提取液，測定其對3種弧菌的最小抑菌濃度（MIC），結果見表3。由表3可見，這些提取物中以五倍子提取物的抑菌效果最好，對擬態弧菌、梅氏弧菌和霍利斯弧菌等的MIC分別為0.172 mg/mL、0.172 mg/mL和0.086 mg/mL，其次是烏梅提取物，對3種弧菌的 MIC 分別為 0.461 mg/mL、0.461 mg/mL 和 0.922 mg/mL，其他提取物的 MIC 范圍在 1.04～167 mg不等（表3）。

表3 9種中草藥提取物對青蟹分離弧菌的最低抑菌濃度（mg/mL）Tab.3 The MIC of 9 Chinese herbs extraction to Vibrio isolates from S.serrata

3 討論

本文對45種中草藥，采用水煎煮法和乙醇法進行了提取，用紙片擴散法分析了45種中藥提取物對青蟹致病性弧菌進行了抑菌測定，結果表明：試驗的45種中藥提取物有28種中藥提取物對1種以上的青蟹致病弧菌表現出抑菌作用，其中五倍子、烏梅、秦皮、艾葉等各種提取物對擬態弧菌SM060818、梅氏弧菌SM060813、霍利斯弧菌SM060913等3種菌株均有較好抑菌作用；天冬、白頭翁、赤芍、金銀花、黃精、黃柏、青蒿等中草藥可對其中1～2種菌株有抑制作用。測定五倍子、烏梅、天冬等對致病弧菌的最低抑菌濃度(MIC)，其中五倍子和烏梅等藥物對擬態弧菌和梅氏弧菌的MIC分別為0.172 mg/mL、0.461 mg/mL，這些結果為抗弧菌中藥有效成份的研究提供了有益線索。

養殖青蟹近年來受到各類疾病的危害，白斑綜合征病毒(WSSV)、血卵渦鞭蟲以及弧菌等感染占青蟹病害的大多數[14,15]，其中弧菌的分離有較多的報道[9,10]。從作者近年來對青蟹分離菌株種類和分布來看，傾向于認為弧菌是青蟹重要的繼發病原，在環境脅迫或其他病原感染時加劇青蟹的發病死亡。尋找有抗弧菌活性中草藥，結合免疫增強劑的應用，對提高青蟹病害控制水平將起到積極作用，還可避免減少單一使用抗菌藥引起的藥物次級污染等危害，在青蟹養殖中有重要的應用價值。

近年來，抗生素誘導的細菌耐藥性受到愈來愈多的關注[3,4]，抗生素的使用限制也日益嚴格，中草藥來源抗菌藥物的應用將日益受到廣大研究者的關注。中藥和其他天然抗菌活性物質是潛在新抗菌藥物的前導化合物，抗菌活性成份的化學特性研究受到廣泛的關注。就本研究測試的45種中藥而言，水煎煮法所提取抑菌成份明顯優于醇提取法，說明抑菌成份多為水性溶性成份，其特點為容易溶解和提取，但后期純化和結構闡述較為困難，同時水煎煮法過程長、能耗大，還存在不耐熱活性成份被破壞的風險，需要采用超聲波、微波等新提取技術。此外，從中藥提取物對弧菌的最低抑菌濃度（MIC）來看，效果最好的五倍子對弧菌MIC為0.172 mg/mL，抑菌效果大大低于目前常用抗菌藥物，這是由于中藥成份較為復雜，直接抗菌成份含量較少而致。許多中藥不同程度地存在免疫增強和機理調理等成份，不能以簡單抑菌作用強弱來評價一種中藥提取物的藥用價值。通過加強對五倍子、烏梅等有較好抗菌力中藥活性成份提取和抑菌機理研究，對于尋找有潛力的抗菌化合物，有重要的應用價值。

[1]吳后波,潘金培.病原弧菌的致病機理[J].水生生物學報,2003,27(4)：422-426.

[2]楊少麗,王印庚,董樹剛.海水養殖魚類弧菌病的研究進展[J].海洋水產研究,2005,26(4)：75-83.

[3]SON R,RUSUL G,SAHILAH A M,et al.Antibiotic resistance and plasmid profile of Aeromonas hydrophila isolates from cultured fish[J].Letters of Applied Microbiology,1997(24):479-482.

[4]LI J,YIE J,FOO R W T,et al.Antibiotic Resistance and Plasmid Profiles of Vibrio Isolates from Cultured Silver Sea Bream,Sparus sarba[J].Marine Pollution Bulletin,1999,39(1):245-249.

[5]張傳亮,李槿年,李小飛.擬態弧菌的致病性、耐藥性及中草藥防治弧菌病應用[J].水利漁業,2007,27(1)：96-98.

[6]王玉娥,邢晨光,王國良.5種海洋致病弧菌對34種中草藥敏感性的測定[J].水產科學,2008,27(5)：221-225.

[7]喻運珍,艾桃山,張萍香,等.53種中草藥對中華鱉主要致病菌的抑菌作用[J].漁業致富指南,1999（9）：45-47.

[8]農業部漁業局,全國水產技術推廣總站.2006年中國水產養殖病害檢測報告[R].2006：7-8.

[9]毛芝娟,卓華龍,楊季芳,等.鋸緣青蟹細菌性傳染病的病原菌研究[J].臺灣海峽,2001,20（2）：87-92.

[10]徐海圣,舒妙安,邵慶均,等.鋸緣青蟹常見病害及其防治技術[J].水產科學,2000,19（5）：24-26.

[11]李少基,陳 武,陳足金.12種中草藥的體外抑菌試驗[J].中獸醫醫藥雜志,2004（1）：44.

[12]侯永清,張 挺.不同提取工藝對中草藥抑菌效果的影響[J].飼料工業,2003,24（2）：9-10.

[13]劉山輝.抗菌藥物的藥敏實驗方法[J].吉林畜牧獸醫,2003（12）：49-50.

[14]劉 問,錢 冬,潘清清，等.WSSV對鋸緣青蟹的致病性及血清酶指標影響[J].水生生物學報,2009,33（6）：1 112-1 117.

[15]施 慧,許文軍,李鵬飛,等.應用P C R方法檢測患“黃水病”鋸緣青蟹中的血卵渦鞭蟲[J].海洋漁業,2008,30(1)：74-79.