環境例行定性分析或快速篩選結果的可靠性

冷 庚，謝 晴，王 彬，楊嘉偉，但德忠

（四川大學建筑與環境學院，四川 成都 610065）

1 引 言

為了迅速獲取環境中的可靠信息，例行分析中定性或快速篩選分析越來越廣泛地被采用。這類方法能為突發性環境事故的快速處置、決策提供依據。在應急監測中，相對于獲得準確的結果而言，人們對樣品濃度是否超出相關標準限量更為重視。此外，定性或快速篩選分析還具有其他一些明顯優勢，如成本低廉、分析速度快、操作簡單以及可將采樣和分析過程中因時間耽擱產生的誤差減至最小等。

對未知樣品的測定，應首先進行定性與快速篩選分析。為了判斷方法是否符合要求，首先必須了解分析方法的相關特征，如精密度、適應性、可靠性以及檢出限等。對定量分析結果的可靠度，人們已進行了較廣泛深入的研究。但是，對定性分析或快速篩選分析結果的可靠度卻少有研究[1-4]。定性分析或快速篩選分析結果的可靠度不能用與定量分析一樣的方式表達，即不能用表示分析結果離散度的一個參數來表示。相反，結果的可靠性本質上具有概率的性質，可以用犯錯誤的概率來表示。這些錯誤是隨機的或是由誤差造成的，是分析結果不可靠的來源。在分析過程中，必須充分考慮不可靠度以及做出誤判的概率。

目前，有人研究了如何處理定性分析或快速篩選分析中結果的可靠性，但在應用方面尚未找到最好的方法[3]。該文介紹用于處理定性分析或快速篩選分析可靠度的一些方法，這些方法均基于概率計算。

2 定性分析中可靠度評估方法

目前，評估不可靠性的方法較多，如貝葉斯定理（Bayes’Theorem）[5]、列聯表（Contingency Tables）[6]法、類似于定量分析中計算不確定度的統計間隔法以及性能曲線法。

2.1 列聯表

列聯表將定性分析視為分類問題。最簡單的情況是將樣品分析結果分為兩種情況。例如，有毒化合物的濃度或是高于或是低于某一特定值。樣品分析的結果可能為正（大于或等于某一特定值），也可能為負（小于某一特定值）。

針對快速篩選分析有兩種結果并可能反映兩種實際情況，可以建立2×2列聯表。表的維度可從2×2到n×p，n和p表示類別的數量。例如，檢測花生中是否含有黃曲霉素，標準允許的最大限量為2μg/g。篩選試驗采用酶聯免疫吸附試劑盒[7]。當黃曲霉素含量高于限量時，發生免疫反應，根據顏色變化判斷結果。如果顏色變為白色（陽性），表明黃曲霉素的含量大于或等于2 μg/g；如果顏色變為藍色（陰性），則黃曲霉素的含量小于2μg/g。試驗300個樣品，通過高效液相色譜分析，發現其中150個樣品的含量大于或等于2μg/g。其余150個樣品含量均低于限量值。測定結果的分布如表1所示。

表1 花生中黃曲霉素快速篩選分析的2×2列聯表

從表1可知，樣品中黃曲霉素的實際含量有“大于或等于”或“小于”兩種情況，對應結果或為陽性（+），或為陰性（-），N為樣本大小。黃曲霉素的分析結果有4種可能的情況：大于或等于2μg/g，分析結果為陽性，稱為真陽性，tp=135；類似地，有真陰性，tn=129；假陰性，fn=15；假陽性，fp=21。利用列聯表還可以評價分析方法的性能，如靈敏度、特異性、陽性預測值（PPV）及陰性預測值（NPV）。

表2 性能參數的計算表達式

表2中的式（1）可用于計算方法的靈敏度，該靈敏度用試驗獲得的真陽性結果數占實際陽性結果總數的比來表示。上例中，方法的靈敏度=（135/150）×100=90%，即分析黃曲霉素含量大于或等于2μg/g的100個試樣時，其中90個試樣的結果呈陽性，10個試樣的結果呈陰性（假陰性）。然而，理想的分析方法測出的100個試樣中黃曲霉素含量均應大于或等于2μg/g。檢測靈敏度也稱為方法的功效。在統計假設檢驗中，功效定義為1-β，β表示獲得假陰性結果的概率[6]。

特異性定義為真陰性數占實際陰性總數的比例，即表2中的式（2）。上例中，方法的特異性=（129/150）×100=86%，即分析黃曲霉素含量低于2μg/g的100個試樣時，其中86個試樣的結果呈陰性，14個試樣的結果呈陽性（假陽性）。而理想的分析方法測出的100個試樣中黃曲霉素含量均應低于2 μg/g。在統計假設檢驗中，特異性與顯著性水平α有關，α表示獲得假陽性結果的概率。

根據不同的分析目的，比特異性更高的靈敏度可能更可取，反之亦然。值得注意的是，靈敏度的增加往往伴隨著特異性的下降，而靈敏度和特異性均取決于樣本大小N。即N越大，列聯表中包含的信息越多，由此計算出的靈敏度和特異性的可靠性就越高。

陽性預測值表示試樣結果呈陽性時，黃曲霉素的實際濃度大于或等于2μg/g的概率。PPV=（135/156）×100=86.5%，表明當有100個試樣的結果呈陽性時，其中86個試樣的含量將大于或等于2μg/g，而有14個試樣的結果呈假陽性。類似地，陰性預測值表示真陰性結果占測出的陰性結果總數的比例。上例中，PNV=（129/144）×100=90%，意味著當有 100 個試樣的結果呈陰性時，其中90個試樣的含量將小于2μg/g，而有10個試樣的結果呈假陰性。

列聯表常用來估計快速篩選分析的可靠性，以及不同分析方法的比較。這種比較是基于不同篩選方法對相同樣本的靈敏度和特異性而言。值得注意的是，不同方法靈敏度和特異性的差異可能是由偶然性造成的，因為實際情況與檢測結果間的差異受隨機誤差的影響，當試樣數量較小時更是如此。為了評估這些可能的差別，某些統計檢驗能從列聯表中獲得一些正確的結論[6]。

列聯表用于生物檢測（如免疫學檢測）時，一些術語和定義與其在分析化學領域中的含義有所不同，如靈敏度和特異性。盡管列聯表為試驗方法的整體性能提供了概貌，但是它不能估算個別樣本出現誤差的概率，而且其性能很大程度上取決于樣本的大小以及用于構建該表的試驗設計。

2.2 貝葉斯法

在處理二分結構（如是/否、存在/不存在、成功/失?。r，貝葉斯法是一種用于表達和更新概率的老方法，在定性分析中已獲得應用[5]。當考慮到歷史和條件概率分布時，貝葉斯定理可對相似情況下采用類似測量的概率進行預測[8]。Ellison等[5]評述了貝葉斯定理在計算定性分析結果可靠性的應用，并認為貝葉斯定理在測量結果可靠度方面比列聯表中的概率更適用。

仍以黃曲霉素為例，在檢測結果呈陽性（p）的條件下，試樣中黃曲霉素含量大于或等于規定限量值（a）的條件概率計算表達式為：

式中：a——黃曲霉素含量大于或等于2μg/g；

b——黃曲霉素含量小于2μg/g。

P（a）和 P（b）是各自的事前概率，表示預先不知道的情況下取得陽性結果p或陰性結果n的概率。先驗概率往往是最難量化的參數。根據歷史數據或經驗可以對先驗概率進行估計。當無法獲得充足的試驗數據，也無法證明黃曲霉素含量是高于還是低于規定限量值時，先驗概率通常設為0.5。

P（p/a）表示黃曲霉素含量大于 2 μg/g時，檢測結果呈陽性的概率，P（p/b）表示黃曲霉素含量低于2 μg/g時，檢測結果呈陽性的概率。這兩種概率分別與假陰性和假陽性的比例有關[9]。

準確地說，假陰性的概率應該是P（n/a），它與P（p/a）有關，即 P（p/a）=1－P（n/a），而 P（p/b）自身就是假陽性概率。Ellison等[5]認為，這些概率可通過諸如直接實驗測定、根據已知或假定的閾值分布以及利用相關數據庫或理論預測的方法來評價。第一種方法最簡單，它包括向待分析任務提交盡可能多的特征材料，然后觀察結果。對大小為N的樣本，已知黃曲霉素含量均低于2μg/g，當檢測結果有p個陽性時，則P（p/b）=p/N。類似地，已知黃曲霉素含量均大于 2 μg/g，當檢測結果有 n 個陰性時，則 P（n/a）=n/N。同理，當試樣中黃曲霉素含量均高于2μg/g時，結果呈陰性的條件概率可用與式（5）類似的式子計算，不同的只是把公式中的P換成為n。

當對先驗概率一無所知時，P（a）和 P（b）都取0.5。如果測試結果與表1相同，利用貝葉斯定理計算的概率如下：

這意味著，當試樣的檢測結果呈陽性時，黃曲霉素含量高于2μg/g的概率為86.5%。用同樣的方法，可計算出 P（a/n）=0.104。

從上述表達式，可以發現列聯表和貝葉斯定理之間存在一定的關系，因為它們都是基于概率論。這種關系可通過似然比來建立，似然比是兩個條件概率的比值，并且與列聯表中靈敏度和特異性這兩個參數有關，通過下式可以計算似然比：

應當指出，如果想用這種方法得到很好的估計值，則需要有大量的分析試樣。從分析的角度來看，貝葉斯法的弊端在系統命名的復雜化以及難以量化不同概率項。與列聯表相比，貝葉斯法不僅能對新試樣的可靠性予以估計，還能通過先驗概率將先前的信息統合到一起。

2.3 統計間隔

目前，Pulido等開發了一種用于計算定性分析結果可靠度的簡單程序[10]，該程序與計算定量分析的不確定相似，都基于統計間隔，服從高斯正態分布，并已廣泛用于計算檢出限[11-12]。該程序能建立濃度的標準限量值和儀器響應信號間的聯系，通過比較常規樣品與標準限量值的響應，便可做出“是/否”的決定，其出錯的概率是確定的。該法與前述方法的區別主要有兩點：由于處理儀器響應信號，因此需要連續數據而非二進制數據；通過實驗確定分析結果的可靠性，需制備標準限量濃度的分析樣，而在前述方法中，需制備不同濃度的分析樣。

當采用統計間隔時，以中等精度對一套獨立制備的含有標準限量濃度待測物的試樣分析nSL次，以求囊括造成結果不可靠的主要來源。這樣，可以計算儀器響應的平均值及其標準偏差s。

為了比較某試樣的儀器響應ri是否低于、等于或高于標準限量，需要確定閾值rcut-off。假設儀器響應服從正態分布，則通過平均值單側的較高或較低預測界限計算rcut-off：

式中：t（α，υ）——顯著性水平為 α、自由度為 υ 時單側T統計值；

nSL——計算進行獨立分析的次數；

m——試樣重復分析的次數（通常m=1）；

s——校正樣品儀器響應的標準偏差。

SSL和υ的值取決于建立的試驗設計。在無試驗設計的情況下，SSL可用式（8）來表示。式（7）中的“±”取決于標準限量以何種方式表述。

仍以黃曲霉素為例，歐盟（EU）相關法規規定其最大含量為2 μg/L。采用熒光快速掃描技術，分析含2 μg/L黃曲霉素B1的34個樣品，結果如下：。當 α=5%時，根據式（7）和式（8）得。因此的任何樣品在統計學上若等于或低于則滿足法規規定。同理，的任何樣品在統計學上若高于rSL，則認為不符合法規規定，該判斷出錯的概率為5%。

由式（7）可知，適應性取決于犯I型錯誤或假陽性的先驗概率α。一旦分析人員取定一個α，那么閾值rcut-off可以幫助分析人員對某樣品的適應性進行后驗決策。即只有相應于測試樣品的儀器響應ri被記錄時，才能做出決定，通過這種方式，測量的可靠度就從分析結果轉移到閾值，通過對ri和rcut-off的簡單數字對比，便能做出適應/非適應的判斷。這種方法適合日常的快速篩選分析。

篩選限rscreening也是在考慮到犯II型錯誤或假陰性的β概率下計算出來的[10，13]。仍以黃曲霉素為例，當試樣中黃曲霉素濃度未超出標準限量CSL時，β是指試樣符合限量要求，而實際卻高于CSL的概率。為了用式（9）計算rscreening，分析人員必須固定3個參數α、β或rcreening-中的兩個，后者是ri和間差異的最小預期值，分析人員希望用試驗結果得到的α和β的概率對其進行計算（如圖1所示）。

圖1 定性分析中考慮了犯I型和II型錯誤的概率α和β時的標準信號、閾值信號以及篩選限

式中：Δ（α，β，υ）——自由度為nSL-1的非中心t分布的非中心參數，它取決于出錯概率α和β。

根據式（9），可推斷出篩選系統中的篩選限取決于犯I型和II型錯誤的概率、篩選方法的精度及實驗結果，而實驗結果又取決于標準和試樣的重復測定次數。當試樣的濃度低于標準限量時，也可通過相同的推理計算篩選限rscreening，只需將式（9）中的加號變為減號。

篩選限是篩選系統的先驗值，一旦將其賦予濃度意義，它便可以用于不同方法的比較或解決某一具體問題方法的選擇。當CSL=0時，篩選限就是檢出限。

這種方法只適于處理能提供數值和連續響應的儀器篩選系統。通常，用于定量分析的儀器法適合作為篩選法。然而，當不能得到二分響應和二元響應時，這種方法不適用。

2.4 性能曲線

評估可靠性的另一種方法就是建立性能曲線[14]，它是通過采用快速篩選技術分析不同濃度的樣品而建立的。通常，需制備不同濃度的標準的樣品空白，使其最終濃度在標準限量值上下。以中等精度對每個濃度的試樣進行多次重復測定，對每個濃度水平計算出陽性結果的數量，據此繪制濃度水平與陽性結果百分比曲線。該曲線可能確定閾值濃度，即對一定的誤差概率，儀器響應的濃度高于標準限量值。此外，對一定的誤差概率α和β，還可以計算出不可靠間隔或區間。

圖2是用前述酶聯免疫吸附試劑盒測定黃曲霉素B1的性能曲線。為此，需制備5個濃度的加標樣品（2個高于標準限量，2個低于標準限量，1個等于2μg/g標準限量），每個濃度重復測定10次，結果見表3。分析完成后，計算陽性與陰性結果的百分數。根據圖2中假陽性或假陰性出錯的概率，可以確定閾值濃度，該濃度在圖上可用一條垂線表示。根據出錯概率的不同，該垂線可以左右移動。如果標準限量濃度（2μg/g）的樣品可以接受，那么出錯的可能性約是50%。在定性或快速篩選分析中，通常關心的是怎樣獲得低的假陰性概率。在這種情況下，閾值水平可設在1μg/g和1.5μg/g之間。例如，若將閾值濃度設為1.5μg/g（垂直線），那么有10%的結果呈假陽性，即可認為10個樣品中有1個高于標準限量，而實際上卻低于該限量。

圖2 性能曲線

表3 標準限量附近不同濃度的空白加標樣品的分析結果

為了確定不可靠區間，假陰性和假陽性率都必須固定。在前例中，如果誤差概率α和β都定為5%，那么不可靠區間在1.25μg/g和2.4μg/g之間。顯然，性能曲線越準確，不可靠區間越窄。而這一點又與每個濃度重復分析的次數和濃度水平的數量有關。

與貝葉斯定理類似，該法的主要缺點是當位于可靠區間內濃度的樣品重復測定次數較少時，在有限樣本容量中獲得陽性或陰性結果的概率也低。此外，考慮到成本和時間，增加重復次數會產生一些消極的后果。當對現行篩選方法的精度缺乏認識，或用試劑盒來分析樣品時，這種方法是有用的，因為試劑盒的響應不是陽性就是陰性。當獲得可疑結果時，性能曲線會發生變化。性能曲線適用范圍廣，適用于所有類型的快速篩選系統。

3 結束語

定性分析或快速篩選分析中結果的可靠性評估方法有四種，具體方法的選擇主要取決于分析問題本身以及所用的快速篩選技術。利用上述方法來估計分析結果可靠性，實驗所需的樣品數量和濃度水平都是不同的。如果利用列聯表估算可靠性，雖然試樣只可能有兩種情況，即高于或低于標準限量值，但分析不同濃度的樣品仍是需要的。同樣，當用性能曲線來處理數據可靠性，仍需分析不同濃度的樣品，且每個濃度需重復測定。當用統計間隔來估算結果的可靠性時，只需分析某個濃度的多個樣品。

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