胃癌組織 Survivin和 Ki-67表達與體外化療藥物敏感性的關系

劉學軍,檀碧波,吳勝春,韓 杰

化療是胃癌綜合治療的重要措施,而腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)的存在常導致化療失敗。因此,預測胃癌細胞的化療敏感性具有重要意義。有研究表明,化療敏感性與腫瘤細胞的增殖和凋亡有關[1-5],而目前關于胃癌細胞增殖、凋亡相關因子表達與化療藥物敏感性關系的臨床研究少有報道。因此,本研究探討了凋亡抑制蛋白 Survivin和反映增殖水平的 Ki-67與胃癌細胞體外化療敏感性的關系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本取自2006年 10月—2007年12月在我院手術并經病理證實的 64例胃癌患者的新鮮腫瘤組織。64例胃癌患者中男 35例,女 29例,年齡 45～77歲,平均 (65.7±9.0)歲。術前均未接受任何治療。術中分別取新鮮腫瘤組織1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm置入雙抗 (青霉素 G鈉 100 U/ml、鏈霉素 200μg/ml)培養液行MTT法體外腫瘤細胞化療藥物敏感性實驗。另每例腫瘤標本經中性甲醛溶液固定,常規石蠟包埋、切片行免疫組化染色。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色測定 Survivin、Ki-67蛋白表達 鼠抗人 Survivin、Ki-67單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購自北京中杉生物技術公司 (美國 Zymed公司產品),采用 SP法分別對腫瘤組織進行免疫組化染色,觀察 Survivin、Ki-67蛋白表達情況,染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。用 PBS代替一抗做陰性對照,用已知陽性切片做陽性對照。由兩位病理醫師分別雙盲閱片進行結果判斷。每張切片隨機取 5個高倍(×400)視野,每視野計數 100個細胞,Survivin以細胞膜及(或)細胞質、Ki-67以細胞核呈黃色著色為染色陽性,按腫瘤細胞著色強度和陽性細胞率分別進行記分。著色強度記分:無著色為 0分,淡黃色為 1分,黃色為 2分,棕黃色為 3分。腫瘤細胞陽性細胞率記分標準:陽性細胞≤5%為 0分,6%～25%為 1分,26%～50%為 2分,51% ～75%為 3分, ≥76%為 4分;兩種記分標準所得分值的乘積為:0～1表示陰性(-),2～3為弱陽性 (+),4～7為陽性 (++),≥8為強陽性 (+++)。表達強度標準:記分≤3為弱表達,≥4為強表達。

1.2.2 體外藥物敏感實驗 (1)所用試劑和儀器:MTT(Sigma公司)、DMEM培養基及胰蛋白酶 (Gibco公司)、DNM-9602A酶標儀 (北京普朗公司產品)、細胞培養板(ZL03236962.X,泰倫生物公司專利產品)。 (2)實驗步驟:胃癌組織經研磨分散,用細胞分離器調細胞濃度為 5×105/ml。使用前將腫瘤藥敏檢測板和 DMEM培養基預溫至 37℃。9種受試藥物為 5-氟尿嘧啶 (5-FU)、長春新堿 (VCR)、足葉乙甙 (VP-16)、紫杉醇 (PTX)、表阿霉素 (eADM)、羥基喜樹堿 (OPT)、奧沙利鉑 (L-OHP)、順鉑 (DDP)、甲氨蝶呤 (MTX),藥物終濃度為血漿峰值藥物濃度[6]。接種細胞懸液 200μl/孔,微量振蕩器振蕩混勻,置于 37℃、5%二氧化碳 (CO2)飽和濕度的培養箱培養 48 h,加 MTT(5 mg/ml)20μl/孔,繼續培養 3～24 h,終止培養時間依據顯微鏡下觀察 MTT被還原成藍色針狀結晶。將細胞培養板 1 000 r/min離心 10 min,棄上清液,吸水紙吸去殘留液體。加入二甲基亞楓 (DMSO)100μl/孔,輕輕振蕩混勻,酶標儀 570 nm測各孔吸光度 (A)值。藥物對腫瘤細胞平均抑制率 (IR)=(1-給藥孔平均 A值 /對照孔平均 A值)×100%。

1.3 統計學方法 實驗數據用 SPSS 13.0統計分析軟件分析。Survivin與 Ki-67相關性采用 Spearman相關分析,藥物對腫瘤細胞的抑制率以 (x±s)表示,組間比較采用 t檢驗。以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中 Survivin、Ki-67蛋白的表達 64例胃癌患者的癌組織中 Survivin、Ki-67陽性表達率分別為 90.6%(58/64)、76.6%(49/64);強表達率分別為 62.5%(40/64)、65.6%(42/64)。經 Spearman等級相關分析顯示,Survivin與 Ki-67的表達呈正相關 (r=0.6354,P＜0.01)。

2.2 胃癌組織中 Survivin、Ki-67表達與化療藥物敏感性的關系 Survivin強表達時,eADM、DDP對腫瘤細胞的抑制率明顯降低 (P=0.013、P=0.042),但 L-OHP對腫瘤細胞的抑制率則明顯增加 (P=0.037);Ki-67強表達組中,5-FU、OPT對腫瘤細胞的抑制率明顯高于弱表達組 (P=0.003、P=0.040),而 eADM對腫瘤細胞的抑制率明顯降低 (P=0.001,見表 1)。

表 1 胃癌組織中 Survivin、Ki-67表達與化療藥物抑制率的關系 (x±s,%)Table 1 Relationship between expression of Survivin,Ki-67 and chemosensitivities in gastric carcinoma

3 討論

增殖和凋亡失調在腫瘤的演進過程中是普遍存在且密切相關的現象,Survivin與 Ki-67是反映腫瘤細胞凋亡和增殖情況的重要指標。Survivin是目前已知功能最強的凋亡抑制蛋白,可通過抑制末端效應分子 Caspase阻止細胞凋亡[7-8],導致MDR的發生;而 Ki67是目前應用最廣泛、能準確反映增殖活性的指標,腫瘤增殖狀態與化療敏感性密切相關[1]。已有研究提示腫瘤細胞 Survivin與 Ki67表達存在正相關性[9-10],本研究也顯示胃癌組織中 Survivin與 Ki67的表達呈正相關關系,說明胃癌細胞的凋亡和增殖水平可能通過某些共同的調控機制而達到平衡,其具體機制尚待進一步研究。

腫瘤 MDR是多種基因/蛋白網絡化調節的最終結果,增殖和凋亡相關蛋白在其中發揮重要作用[2-3,11]。多數胃癌化療藥物通過損傷 DNA、誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖而發揮抗腫瘤作用。本研究中有 5/9種藥物的耐藥與 Survivin、Ki67之一過表達有關,其中 eADM的耐藥與兩者均有相關性,表明Survivin、Ki67可能在這些藥物作用靶點后抑制腫瘤細胞凋亡或促進腫瘤細胞增殖而產生 MDR表型;腫瘤對 eADM耐藥與Survivin、Ki67共表達有關,Survivin和 Ki67具有協同抑制凋亡、促進增殖而參與腫瘤 MDR產生的作用。本研究也顯示尚有 4種藥物的耐藥與 Survivin、Ki67的表達程度無關,說明Survivin、Ki67可能僅是決定化療敏感性的因素之一,腫瘤細胞對 VCR、VP-16、PTX、MTX耐藥可能涉及 MDR1/P-gp、GST-π、ToPo等其他 MDR途徑。本研究還發現,L-OHP對Survivin過表達的腫瘤細胞抑制率明顯增加,說明了胃癌 MDR的復雜性,其具體機制尚待進一步研究。

本研究初步證實了胃癌組織 Survivin、Ki67表達與部分化療藥物的耐藥性有關,測定 Survivin、Ki67表達程度對預測胃癌 MDR及化療藥物敏感性具有一定意義。但胃癌 MDR是由多種耐藥相關因子通過復雜的網絡化調節而形成的,增殖和凋亡情況僅反映了其中部分機制,對胃癌 MDR進行分析時應綜合考慮其他多種因素。

1 Wang R,Lin F,Wang X,et al.Silencing Livin geneexpression toinhibit proliferation and enhance chemosensitivity in tumor cells[J].Cancer Gene Ther,2008,15(6):402-412.

2 Parsch D,Brassat U,Brümmendorf TH,et al.Consequences of telomerase inhibition by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines[J].Cancer Invest,2008,26(6):590-596.

3 Wei SH,Dong K,Lin F,et al.Inducing apoptosis and enhancing chemosensitivity to Gemcitabine via RNA interference targeting Mcl-1 gene in pancreatic carcinoma cell[J].Cancer Chemother Pharmacol,2008,62(6):1055-1064.

4 Nagamatsu K,Tsuchiya F,Oguma K,et al.The effect of small interfering RNA(siRNA)against the Bcl-2 gene on apoptosis and chemosensitivity in a canine mammary gland tumor cell line[J].Res Vet Sci,2008,84(1):49-55.

5 Robert J.Multidrug resistance reversal agents[J].Drugs Fut,1997,22(2):149-150.

6 韓杰,檀碧波,呂炳蓉,等 .胃癌與大腸癌原代細胞培養化療藥物敏感性的對比 [J].中華普通外科雜志,2008,23(6):464-465.

7 Shin S,Sung BJ,Cho YS,et al.An anti-apoptotic protein human Survivin isa direct inhibitor of caspase-3 and-7[J].Biochemistry,2001,40(4):1117-1123.

8 周衛東.Caspase-3和 Survivin在膀胱移行細胞癌中的表達及其相關性 [J].中國全科醫學,2009,12(7):1339.

9 申愛方,楊興升,陳冰,等.Ki-67抗原和 Survivin基因在上皮性卵巢癌中表達增強且相關 [J].基礎醫學與臨床,2006,26(3):312-314.

10 李秀娟,廖琪,孫中華,等 .Ki67和 Survivin在卵巢上皮性癌中的表達及意義 [J].中國全科醫學,2009,12(8):1534.

11 韓杰,檀碧波,耿瑋,等.消化道腫瘤組織中 P-gp、凋亡抑制蛋白表達與體外化療藥敏性的關系及其及意義 [J].癌癥,2008,27(11):1166-1171.