腺病毒介導的熱休克蛋白 70表達對神經元氧化應激損傷的保護作用

宋曉聰,楊芳芳,胡 丹,曲 彥

熱休克蛋白 (heat shock proteins,HSPs)是生物體或離體培養細胞在熱應激等不良環境下由熱休克基因編碼產生的一組具有高度保守性的應激蛋白,廣泛存在于原核細胞和真核細胞中。在熱休克蛋白家族中,熱休克蛋白 70(heat shock protein 70,HSP70)家族是最保守、最豐富,也是研究最為深入的一種[1]。在腦卒中、顱腦創傷等所致的腦缺血再灌注過程中,腦缺血缺氧引起的氧化應激反應所產生的大量氧自由基是引起腦損傷的主要原因之一[2]。目前,如何保護神經組織免受氧化應激損傷成為醫學研究的一個重要課題。本實驗以重組腺病毒介導外源性 HSP70在體外培養的神經元和膠質細胞中表達,再以過氧化氫 (H2O2)誘導細胞損傷作為細胞氧化應激損傷的模型,觀察外源性 HSP70表達對 H2O2所致神經元和膠質細胞毒性的影響,以探討 HSP70是否具有抗氧化的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 重組腺病毒 vAd-HSP70和腺病毒載體對照 vAd-GFP由本課題組構建并保存[3]。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于南京建成科技有限公司;鼠抗人HSP70單克隆抗體購于美國 Santa Cruz生物技術公司;辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG和羊抗兔 IgG購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 體外神經元和膠質細胞的培養 取出生時間 ＜24 h的新生昆明種小鼠 (購自青島市藥品檢驗所),在無菌條件下斷頭取大腦皮質,去除軟腦膜,剪碎皮質,經消化、離心,加培養液制成細胞懸液,接種于 75 cm2培養瓶,置 37℃,5%CO2培養箱中培養。具體過程參見文獻 [4]。靶細胞主要為神經元和膠質細胞。

1.3 感染靶細胞及氧化應激模型的建立

1.3.1 實驗分組 對照組包括正常細胞對照組 (未感染組)和腺病毒對照組 (vAd-GFP感染組);實驗組為重組腺病毒vAd-HSP70感染組。病毒感染組在感染 48 h時經 0.5 mol/L H2O2處理,同時未感染組也給予氧化應激處理。

1.3.2 感染靶細胞 體外培養神經元和膠質細胞達 70%～80%融合時,棄去培養液,用 PBS洗細胞單層一次,接種 200 μl低溫保存的重組腺病毒懸液,37℃吸附 30 min,加維持液繼續培養。

1.3.3 氧化應激模型 將 30%H2O2用無血清 DMEM稀釋成終濃度為 0.5 mmol/L的處理液,現配現用。將 3組細胞在無菌條件下棄去培養液,加入配好的處理液,液體完全覆蓋靶細胞作用 1 h。之后,棄去處理液,PBS沖洗 1次,加入正常培養液繼續培養 24 h后做相應檢測。

1.4 病毒感染靶細胞效應的檢測 采用 RT-PCR檢測靶細胞中 HSP70轉錄,Western blotting檢測靶細胞中 HSP70蛋白表達,MTT檢測細胞增殖。

1.4.1 RT-PCR檢測靶細胞中 HSP70轉錄 收集病毒感染48 h后的各組細胞,Trizol一步法提取細胞總 RNA,按照反轉錄試劑盒要求的標準條件合成 cDNA用作 PCR模板。利用Primier primer 5.0引物設計軟件設計擴增 HSP70編碼基因的特異性引物,上游引物 5′-CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC-3′, 下游引物 5′-GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC-3′,擴增產物長度為 1 486 bp。PCR反應體系及擴增條件參見文獻 [4]。取5μl PCR擴增產物于 0.8%的瓊脂糖凝膠 (含0.5 mg/L溴化乙錠)中電泳,凝膠自動成像系統觀察結果。

1.4.2 Western blotting檢測靶細胞中 HSP70蛋白表達 重組腺病毒感染靶細胞 48 h后收集細胞,用裂解液 (400μl RIPA+4μl PMSF)提取細胞總蛋白,取 50μg蛋白上樣行 SDSPAGE電泳、轉膜、封閉,依次加抗 HSP70抗體 (1∶500稀釋)、兔抗鼠抗體 (1∶500稀釋)作用,最后 X線片曝光、顯影和定影后觀察結果。

1.4.3 MTT檢測細胞增殖 制備 1×106個 /ml的對數生長期細胞懸液接種于 96孔細胞培養板,每孔 200μl。細胞過夜貼壁后每孔接種病毒 2μl,vAd-GFP感染組和 vAd-HSP70感染組均設 3個平行孔,以無細胞培養液孔作為對照孔。經氧化應激處理后各孔加 10μl MTT溶液 (5 mg/ml),37℃繼續培養 4 h,每孔加 150μl二甲基亞楓 (DMSO)終止反應,振蕩10 min,用酶標檢測儀在 490 nm波長下測定吸光度 (A)值。測定 3次取平均值。

1.4.4 LDH活力檢測 取對數生長期細胞,接種于 24孔培養板,細胞過夜貼壁后每孔接種重組腺病毒 5μl,根據實驗分組,每組均設 6個平行孔,各組經氧化應激處理后24 h,收集培養上清液,檢測 LDH活力,取 6次檢測值的平均值。

1.4.5 電鏡檢測細胞超微結構 將各實驗組細胞經 H2O2處理后收集,固定、脫水、常規包埋、超薄切片、染色后在透射電鏡下觀察、拍照。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理,數據以 (x±s)表示,3組均值間的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靶細胞中重組腺病毒 vAd-HSP70的表達 倒置熒光顯微鏡觀察可見重組腺病毒感染靶細胞 48 h后感染率達 80%(見圖1)。RT-PCR檢測結果顯示重組腺病毒 vAd-HSP70感染組可觀察到 HSP70編碼基因 1 486 bp的特異性擴增帶;而未感染組和 vAd-GFP感染組細胞無此條帶 (見圖 2)。Western blotting檢測結果顯示重組腺病毒 vAd-HSP70感染組出現HSP70蛋白條帶;而未感染組和 vAd-GFP感染組細胞相應位置無特異條帶 (見圖3)。

2.2 HSP70表達對靶細胞活力的影響 H2O2氧化應激處理后,用 MTT法檢測各組的吸光度值以間接反映細胞活力,連續檢測 6 d。vAd-HSP70感染組細胞活力始終高于其他兩組(P＜0.01,見表 1),表明細胞有較強的生長能力。從第 4天起,vAd-GFP感染組和未感染組細胞逐漸凋亡 (見圖 4)。

圖 1 重組腺病毒感染 48 h后的靶細胞Figure 1 The target cellsinfected by recombinant adenovirus at 48 h A:vAd-HSP70 infected target cells;B:vAd-GFP infected target cells

2.3 LDH活性變化 各組細胞氧化應激處理 24 h后,vAd-HSP70感染組培養液中 LDH活性為 (976±106),低于 vAd-GFP感染組和未感染組 〔分別為 (1 332±197)和 (1 380±121)〕,差異有統計學意義 (P＜0.01),而 vAd-GFP感染組和未感染組培養液中 LDH活性間差異無統計學意義 (P＞0.05)。

2.4 透射電鏡下觀察細胞超微結構的變化 透射電鏡下觀察經 H2O2處理后各組細胞超微結構的變化。vAd-HSP70感染組細胞的胞膜較清晰完整,細胞核致密,核膜清晰,其形態與正常對照細胞接近。vAd-GFP感染組和未感染組細胞的胞膜邊界不清,細胞質中出現空泡,核仁松散甚至核仁組分分離,部分細胞可見細胞核裂解等不可逆性損傷 (見圖 5)。

圖 2 RT-PCR檢測神經元中 HSP70的表達Figur e 2 HSP70 expression in neuronal cells detected by RT-PCR lane 1:PCR marker DL2000;lane 2:positive control(Hela cells);lane 3:vAd-HSP70 infected neuronal cells;lane 4:vAd-GFPinfected neuronal cells;lane 5:uninfected neuronal cells control

圖 3 Western blotting檢測神經元中 HSP70的表達Figure 3 HSP70 expression detected by Western blotting in neuronal cells Lane 1:positive control(MCF-7 cells);Lane 2:vAd-HSP70infected neuronal cells;lane 3:vAd-GFP infected neuronal cells;Lane 4:uninfected neuronal cells control

圖 4 HSP70表達對靶細胞增殖能力的影響Figure 4 The effect of HSP70 expression on target cell proliferation

圖 5 透射電鏡觀察各組細胞超微結構變化 (×10 000倍)Figur e 5 The changesof the ultrastructure of cells observed with the transmission electron microscope A:neuronal cells control;B:vAd-HSP70 infected neuronal cells;C:vAd-GFP infected neuronal cells;D:uninfected neuronal cells control

表 1 MTT檢測各組細胞的活力 (x±s)Table 1 Viability of cells tested by MTT

3 討論

氧化應激是缺血再灌注引起組織損傷的主要原因之一,而腦組織對缺血缺氧最為敏感,耐受性差。此外,臨床上有許多神經退行性疾病如脊髓側索硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病等都被認為與氧化應激損傷有關[5]。近年來,通過高熱預處理誘導內源性 HSP的表達以探討 HSP的細胞保護作用的研究較多。Joyeux等[6]研究表明高熱預處理可以抵抗大鼠心肌的缺血再灌注損傷。體外實驗也證明高熱預處理對 H2O2所致的心肌細胞氧化應激損傷具有保護作用[7]。張廣雄等[8]研究表明高熱預處理對神經元的氧化應激損傷有保護作用。本實驗通過成功誘導體外培養的神經元中外源性 HSP70的表達,來探討外源性 HSP是否同樣具有抗氧化應激的保護作用。

成功誘導外源性 HSP表達成為本研究的關鍵。本研究采用重組腺病毒為載體將外源性 HSP70編碼基因導入靶細胞,該載體系統具有構建簡單,宿主廣泛,感染效率高,特異性強,安全性好等特點。由于重組腺病毒攜帶 GFP的編碼基因,因此可在包裝增殖的同時直接用熒光顯微鏡觀察轉染及感染效率。且重組腺病毒 vAd-HSP70能有效感染小鼠原代神經元,用 RT-PCR和 Western blotting在重組腺病毒 vAd-HSP70感染的神經元均可檢測到 HSP70的表達,而未感染組和 vAd-GFP感染組的神經元未檢測到 HSP70的表達,表明重組腺病毒能在靶細胞中有效表達。

MTT可反映細胞內線粒體內膜琥珀酸脫氫酶的活性,從而反映線粒體的功能,因此,被廣泛用作細胞呼吸和活力的指標,反映線粒體的整體功能。線粒體是細胞供能的場所,其功能喪失意味著細胞死亡,因此同等條件下 MTT檢測吸光度值大小可以反映細胞活力的高低。各組細胞經 H2O2處理后,對照組細胞的活力明顯下降,與 vAd-GFP感染組比較,重組腺病毒 vAd-HSP70感染組細胞仍有較強的活力;表明重組腺病毒介導的外源性 HSP70表達能維持線粒體的整體功能,從而抵抗 H2O2誘導的氧化應激損傷,起到細胞保護作用。

LDH是細胞內的標志酶。細胞受損時,細胞膜通透性升高,細胞內 LDH釋放至細胞上清液,且釋放量與細胞受損程度呈正相關,因此通過檢測細胞上清液中 LDH釋放量即可反映細胞受損情況。LDH的檢測結果顯示,各組細胞經 H2O2處理后,對照組的細胞培養上清液中 LDH活力明顯增加。這表明 H2O2誘導的氧化應激損傷能導致細胞膜的損傷;而 vAd-HSP70感染組細胞培養液中 LDH活力則較低,提示外源性HSP70在靶細胞中的表達能增強細胞膜的穩定性,對細胞起到保護作用。由此可見,HSP70過表達可顯著減輕神經元和膠質細胞氧化應激損傷的程度。

各種原因導致的腦組織缺血缺氧損傷,都伴隨大量氧自由基的產生,氧自由基能夠直接損傷多種細胞器從而使細胞超微結構發生變化。電鏡結果顯示,H2O2作用 1 h后,vAd-HSP70感染組細胞的胞膜完整,核仁致密,核膜清晰,大多數細胞線粒體清晰可見;而其他兩組細胞損傷明顯,大量細胞的胞膜界限不清,線粒體腫脹,核仁松散甚至核仁組分分離,部分細胞可見細胞核裂解等不可逆性損傷。電鏡結果與 MTT及LDH檢測結果相符合,這也能夠進一步解釋 H2O2處理后第 1天 vAd-HSP70感染組細胞活力就明顯大于其他兩組細胞的原因。

綜上所述,重組腺病毒 vAd-HSP70介導的外源性 HSP70基因在體外培養的神經元和膠質細胞中表達可以起到抗氧化應激的作用。這與 Yenari等[9]研究結果一致,其采用嗜神經性單純皰疹病毒作為載體將 HSP70基因導入腦卒中、心跳停止和中毒等實驗動物模型中,結果顯示外源性 HSP70高表達可提高神經元的存活率,能抵抗不同原因所致的腦損傷。本課題組的研究也表明,腺病毒介導的外源性 HSP70表達可保護體外培養的神經元和膠質細胞抵抗缺氧再復氧損傷,具有明確的細胞保護作用[4]。然而目前,對外源性 HSP70具體的作用機制仍不明確。于如同等[10]實驗顯示,高熱預處理可以減少氧化應激神經元一氧化氮 (NO)的產生,從而起到神經保護作用。大量研究表明,應激狀態下,HSP70可在細胞內不同的部位定位,如線粒體、內質網、細胞骨架等,以發揮其抗損傷的作用[11-12]。在應激狀態下,核仁的結構與功能會發生改變,HSP70可向核仁移位從而減輕氧化應激所致細胞核仁損傷[13-14]。這一機制與本研究結果一致。高熱預處理誘導內源性 HSP70表達對細胞的保護作用機制與外源性 HSP70的作用機制是否一致,這一問題需要進一步的研究。

本課題組成功構建了攜帶 HSP70基因的重組腺病毒,并能在靶細胞中有效地表達,且進一步證實了重組腺病毒介導的HSP70表達在神經元中有明顯的抗缺氧及抗氧化應激作用。這為以后的體內實驗奠定了基礎。

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