4-甲基咪唑雙膦酸的合成及其99Tcm標記

翟好真,羅世能,王 燕,邱 玲,林建國,夏詠梅

(1.江南大學 化學與材料工程學院,江蘇無錫 214122;2.江蘇省原子醫學研究所,衛生部核醫學重點實驗室,江蘇省分子核醫學重點實驗室,江蘇無錫 214063)

有關研究[1-3]表明,雙膦酸鹽類藥物在預防惡性腫瘤骨并發癥和降低乳腺癌患者死亡率方面有重要作用。2003年,Reid[4]確定了雙膦酸鹽類藥物在預防骨質疏松癥方面的作用。雙膦酸鹽類藥物的研發經歷了三代:第一代是以氯屈膦酸鹽為代表;第二代是以帕米膦酸二鈉為代表的含氮雙膦酸鹽,其抑制骨吸收的作用優于第一代藥物;第三代包括具有雜環結構的含氮雙膦酸鹽唑來膦酸和含氮不含環狀結構的伊班膦酸,作用強度和療效較第二代明顯提高,尤其是唑來膦酸鹽類,因其能特異性地作用于骨骼,對于癌癥骨轉移患者及惡性腫瘤引起的高鈣血癥患者有突出療效[5]。

近年來,核醫學有了突飛猛進的發展,尤其是在醫學顯像方面,出現了一大類具有放射性骨顯像作用的藥物,相比傳統的醫學顯像技術具有早診斷、早治療的優點。99Tcm標記亞甲基雙膦酸鹽是目前臨床上應用最廣泛的一類放射性骨顯像劑[6],但其在體內清除較慢,給藥后需要3～4 h顯像。99Tcm標記唑來膦酸鹽類是目前療效和顯像效果綜合應用較好的一類藥物,國內外有多項相關報道[7-12]。本研究擬以4-甲基咪唑為原料,合成 1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(M4 IDP),并對其進行99Tcm標記,探討最佳標記條件,測定標記物體外穩定性,為后期的生物學分布和顯像實驗做基礎。

1 主要實驗材料

Yanadimoto型熔點儀:日本YANACO公司;VARIO ELⅢ型元素分析儀:德國elementar公司;傅里葉變換紅外光譜儀:Bruker光譜儀器公司;WatersPlatform ZMD4000型質譜儀:美國Waters公司;Bruker AM400型核磁共振儀:Bruker光譜儀器公司;PackardCobra型自動γ計數器:美國 Victoreen公司;4-甲基咪唑:上海瀚鴻化工科技有限公司。99Tcm:740 GBq/L,江蘇省江原醫院。其余化學試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(M4 IDP)的合成

M4IDP的合成路線示于圖1[7-10]。采用IR、MS及1H NMR對圖1中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進行結構鑒定。

2.1.1 2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸乙酯(Ⅱ)的合成 在150 m L的三口燒瓶中加入8.2 g 4-甲基咪唑(Ⅰ)(0.1mol)、8.4 g KOH(0.15mol)、13.8 g K2CO3(0.1 mo l)、0.7 g四丁基溴化銨(2mmol)和75m LCH 2 Cl2,室溫攪拌0.5 h后,將11.2m L溴乙酸乙酯(0.1mol)緩慢滴入,回流反應8 h后過濾,濾餅用40 m L CH2Cl2洗滌2次,濾液用 150 m L飽和NaCl溶液洗滌,分層,有機相用無水Na2SO4干燥,之后蒸餾除去溶劑,得到10.6 g棕褐色粘稠液體,即2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸乙酯(Ⅱ)。

2.1.2 2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸(Ⅲ)的合成在250m L三口燒瓶中加入8.4 g(0.05mol)

2.1.1節所得Ⅱ、100 m L蒸餾水和1 m L濃鹽酸,加熱回流反應8 h后,加入2 g活性炭回流脫色0.5 h,之后熱過濾得淺褐色水溶液,蒸餾去除溶劑得淺褐色粘稠狀液體,向其中加入丙酮,攪拌后有固體析出,抽濾,干燥,之后用異丙醇重結晶得到白色固體6.1 g,即2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸(Ⅲ)。

圖1 M4IDP的合成路線

2.1.3 1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(Ⅳ)(M4IDP)的合成 在250 m L三口燒瓶中加入5.6 g(10.04 mol)2.1.2節所得Ⅲ,40m L氯苯和8m L質量分數為85%的H 3 PO4,混勻,混合物加熱至100℃,攪拌反應 0.5 h,之后將溫度降至65℃時,緩慢滴加入10.4 m L三氯化磷(約 0.5 h滴加完畢),繼續升溫至100 ℃,反應 3 h,冷卻,加入 50 m L 9 mol/L的鹽酸回流反應6 h,冷卻,將反應液倒入冷乙醇中,有固體析出,抽濾,干燥,用水重結晶,得白色固體3.4 g,即為目標終產物M4IDP(Ⅳ)。

2.2 99Tcm-M4IDP的制備

取250 mg M4 IDP,用0.1 mol/L NaOH 溶液溶解,之后加水稀釋至5m L,配制成50 g/L的鈉鹽溶液,pH約6,備用。

將10 mg SnCl2·2H2O用10 m L 1 mol/L的鹽酸溶解,配制成1 g/L的SnCl2·2H2 O鹽酸溶液,備用。

在西林瓶中加入雙膦酸鈉鹽溶液和SnCl2·2H2O的鹽酸溶液,用0.2 mol/L pH 6的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)調節混合液的pH,再向其中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,充分混勻,反應,即得99Tcm-M4IDP。

2.3 標記率及放化純度的測定

用紙層析法測定99Tcm-M4 IDP的標記率。取新華一號紙作為紙層析支持物,展開劑為V(丙酮)∶V(水)=2∶1,展開約 10 min后取出晾干,重復操作 3次,計算99Tcm-M4IDP、99TcmO2、99TcmO-4的 Rf分別為 0.2～0.4 、0、0.9～1.0,用γ計數器測各組分的放射性計數,計算標記率。

由于放化純度在某種程度上與標記率相當,標記物未經進一步純化[13]。

2.4 標記條件的優化

2.4.1 反應時間對標記率的影響 取12個西林瓶,用移液器向每個瓶中加入0.1 m L M4 IDP鈉鹽溶液和0.1m L 1g/L的SnCl2·2H 2O溶液,用pH 6的PBS溶液調節體系pH約為6,向每個瓶中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,總體積控制為約2m L,每個反應瓶分別在室溫下反應 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。用紙層析法測標記率。

2.4.2 pH對標記率的影響 取5個西林瓶,用移液器向每個瓶中加入0.1 m L M4IDP鈉鹽溶液和0.1m L SnCl2·2H2O溶液,用pH 6的PBS溶液調節每個瓶中的pH 分別為 4、5、6、7和 8,再向每個瓶中分別加入 37 MBq的Na99TcmO4洗脫液,總體積控制在約2 m L,室溫反應30min。用紙層析法測標記率。

2.4.3 SnCl2·2H 2O用量對標記率的影響取10個西林瓶,用移液器向每個瓶中加入0.1m L M4 IDP鈉鹽溶液,再分別加入含0.005、0.01、0.03、0.05、0.08、0.10、0.12、0.15、0.20和0.25m g SnCl2·2H2O的水溶液,之后用pH 6的PBS溶液調節每個瓶中的pH約為6,再向每個西林瓶中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,總體積控制在約2m L,室溫反應30 min。用紙層析法測標記率。

2.4.4 配體用量對標記率的影響 取12個西林瓶,用移液器向每個瓶中分別加入含 1.0、1.5 、2.0 、2.5 、3.0 、3.5 、4.0 、4.5 、5.0 、6.0 、8.0和10.0mg M4IDP鈉鹽溶液,0.1 m L 1.0 g/L SnCl2·2H 2O溶液,用PBS溶液調每瓶中體系pH約為6,再向每個西林瓶中加入37 MBq Na99TcmO4洗脫液,總體積控制在約2 m L,室溫反應30m in。用紙層析法測標記率。

2.5 99Tcm-M 4 IDP的體外穩定性測定

將最佳標記條件下新制備的99Tcm-M4IDP置于室溫(25℃)下,分別于 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 、5.0、5.5、6.0 h 時取樣測定放化純度,考察99Tcm-M4 IDP在室溫下的穩定性。

3 結果與結論

3.1 M4IDP和主要中間體的表征

2-(4-甲基-1H-咪唑基)乙酸(Ⅲ):產率為54.8%,白色固體。mp:153～156℃;IR(KBr),σ/cm-1:3 328,1 644,1 603,1 450。ESI-MS(m/z):139(M)。1H NMR(500 MHz,DMSO):δ9.06(s,1H,CH ring),δ7.45(s,1H,CH ring),δ5.14(s,2H,CH 2 COOH), δ2.22(s,3H,CH3),[同分異構體:δ9.00(s,1H,CH ring),δ7.42(s,1H,CH ring), δ5.10(s,2H,CH2COOH),δ2.22(s,3H,CH3)] 。 C6H8N2O2元素分析值(計算值):C:51.38%(51.42%),H:5.67%(5.75%),O:22.95%(22.83%),N:19.99%(19.99%)。

1-羥基-2-(4-甲基-1H-咪唑基)-乙烷-1,1-雙膦酸(Ⅳ):產率 29.7%;白色固體。m p:227～231 ℃;IR(KBr),σ/cm-1:3 398,3 200,2 930,2 875,1 665,1 620,1 448,1 245。ESI-MS(m/z):285(M-)。1H NMR(500 MHz,DMSO):δ7.54(s,1H,CH ring), δ6.86(s,1H,CH ring),δ4.30(s,2H,NCH2),δ2.01(s,3H,CH3),[同分異構體:δ7.78(s,1H,CH ring),δ6.57(s,1H,CH ring), δ4.30(s,2H,CH2COOH),δ2.14(s,3H,CH3)]。C6H12N2O7P2元素分析值(計算值):C:25.19%(25.19%),H:4.18%(4.23%),O:39.11%(39.14%),N:9.83%(9.79%)。

當咪唑環1N上有氫時,氫原子可以在兩個氮原子間遷移,C-4和C-5是等同的,存在兩個互變異構體,這兩個互變異構體無法分離,化合物(Ⅲ)的1H NMR譜中顯示C-4與C-5的同分異構體的比例為1∶1,化合物(Ⅳ)的1H NMR中顯示C-4與C-5的同分異構體的比例為3∶1。

3.2 99Tcm-M4 IDP標記條件的選擇

3.2.1 反應時間對標記率的影響 反應時間對標記率的影響示于圖2。由圖2可知,反應0～30min,標記率與反應時間基本呈正相關,當反應時間達到30 min時,標記率＞95%,30 min后,標記率基本穩定。因此,選定最佳反應時間為30min。

圖2 反應時間對標記率的影響

3.2.2 pH對標記率的影響 pH對標記率的影響示于圖3。由圖3可知,pH為4～6時,標記率隨著pH的增大而增大,pH為6時,標記率達到最大97.6%。繼續增大pH,標記率則開始下降。因此,選取反應體系pH為6時作為最佳標記體系。

3.2.3 SnCl2·2H2O用量對標記率的影響SnCl2·2H2O用量對標記率的影響示于圖4。

圖3 pH對標記率的影響

由圖4可知,SnCl2·2H2O用量為30μg時,標記率＞93%,增加SnCl2·2H2O用量,標記率成緩慢上升趨勢,當其用量為100μg時,標記率＞95%,此后再增大其用量,標記率又略有減小。這是由于SnCl2·2H2O過多,容易生成膠體,致使標記率降低。因此,選取SnCl2·2H2O最佳用量為100μg。

圖4 SnCl2·2H 2O用量對標記率的影響

3.2.4 配體用量對標記率的影響 M4IDP配體用量對標記率的影響示于圖5。由圖5可知,當配體用量在5mg以下時,標記率與配體用量呈正相關趨勢,用量為5 mg時,標記率已超過95%,繼續增加配體用量,標記率趨于穩定。因此,選定M4IDP的最佳用量為5mg。

3.3 最佳條件下的標記

綜上所述,99Tcm-M4 IDP的最佳標記條件為:反應時間30 min,反應體系 pH 6,SnCl2·2H2O用量為 100μg,M4IDP的標記用量為5m g。選用最佳標記條件得到99Tcm-M4IDP的標記率＞95%。

3.4 99Tcm-M 4 IDP的體外穩定性

圖5 配體用量對標記率的影響

99Tcm-M4IDP在室溫下存放0.5～6 h,其放化純度的變化示于圖6。由圖6可知,放化純度在這段時間段里只有略微波動,平均放化純度＞95%,說明其體外穩定性較好,即可以在室溫下穩定存放6 h。

圖 6 99Tcm-M4IDP的體外穩定性

4 小 結

本實驗合成了M4IDP,并對其進行了99Tcm標記,優化了99Tcm-M4IDP的標記條件。合成路線和標記方法簡單、易操作,且標記率高,為后續研究99Tcm-M4IDP的臨床前藥理實驗打下基礎。

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