Real-time PCR方法檢測肉品中的沙門氏菌

方 平，楊永莉，楊 寶，王曉聞

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

在我國，沙門氏菌污染引起的食物中毒占食源性疾病中細菌食物中毒病例的70%～80%[1]，且WHO已將沙門氏菌列入具有嚴重為害和中等為害的食物傳播性病原[2]。而沙門氏菌常規檢測方法和普通PCR方法的靈敏度及檢測所需要的時間還有待于進一步提高。

本研究用普通PCR方法檢測引物對沙門氏菌的特異性，并用SYBR Green I作為熒光染料，擬用Real-time PCR方法檢測熟制牛肉和香腸中沙門氏菌，以建立一種檢測肉品中沙門氏菌速度快、靈敏度高的方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

試驗樣品：熟制牛肉（市售）、香腸（市售）。

試驗菌株：沙門氏菌和非沙門氏菌標準菌株各10株（表1）。

SYBR Green I，dNTP，buffer，Taq 酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Ladder購自天根生物（北京）有限公司。

1.2 主要儀器與設備

DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠），Mx3000P熒光定量PCR儀（Stratagene公司，美國），Scientz-04無菌勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司），WFH-201BJ紫外可見透射反射儀（上海精科實業有限公司）。

1.3 引物的選擇與合成

本試驗選用Wang等[3]報道的fimI基因序列中的1對引物，其序列如下。

上游引物為 5′-CCTTT CTCCA TCGTC CTGAA-3′；下游引物為5′-TGGTG TTATC TGCCT GACC-3′。這對引物可擴增沙門氏菌fimI基因中1段大小為85 bp的序列，引物由北 京奧科生物技術有限公司合成。

表1 試驗所用菌株

1.4 樣品的前處理

取過夜培養的鼠傷寒沙門氏菌的營養肉湯增菌液，按10倍梯度進行稀釋，分別取10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10的 稀釋液1 mL于25 g無菌操作剪碎的肉沫中，同時選3個稀釋梯度的稀釋液，吸取1 mL進行沙門氏菌的菌落記數，分別作3個平行樣品，同時作空白對照組，并用常規檢測沙門氏菌的方法檢測原肉品作對照。將已加菌液的肉沫加入225 mL的無菌生理鹽水，置于500 mL的三角瓶中，進行無菌操作勻漿，然后分別吸取1 mL勻漿液進行菌落記數，同時吸取1 mL用于提取DNA。將剩余的菌液置于37℃下振蕩培養，每隔1 h吸取1 mL勻漿液提取DNA。如此操作，每個稀釋梯度的樣品進行6次DNA的提取試驗。

1.5 反應模板的制備

關于沙門氏菌DNA的制備方法有許多介紹[4]，本試驗依據《分子生物學實驗指導》中的經典分子生物學細菌總DNA提取方法[5]進行。

提取熟制牛肉中的沙門氏菌DNA的步驟如下[6-7]。（1）將沙門氏菌標準菌株接種于營養肉湯培養基中，37℃培養18 h，取細菌培養液1 mL于Eppendorf管中離心，棄去上清液。（2）沉淀中加入567 μL TE緩沖液，用吸管反復吹打沉淀，使之重新懸浮；加入30 μL10%SDS和3 μL20 mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，37℃溫育1 h。（3）取上清液加等體積氯仿/異戊醇混合液（體積比為24∶1）搖勻，冰浴 10 min，14 000 r/min離心5 min。取上清液，加等體積酚/氯仿/異戊醇混合液（體積比為25∶24∶1）搖勻，冰浴10 min，14 000 r/min離心5 min，取上清液。（4）將上清液轉移到另一新的離心管中（約200 μL），加入2倍體積預冷的無水乙醇（400 μL），置于-20℃冰凍1 h或過夜。（5）14 000 r/min低溫高速離心15 min，棄去上清液，離心管倒置，風干，用30 μLTE緩沖液溶解，于-20℃冰箱放置備用。

以牛肉中的沙門氏菌DNA的提取方法為基礎提取香腸中沙門氏菌DNA時，由于香腸中加入了許多淀粉、調味料等多種成分配料，使得DNA模板的提取難度增加。在1.5中（1）～（3）步驟后，如果上清液不能順利地完成，可以再重復步驟（3）的操作，同時，在步驟（3）后，再加一步丙三醇清洗來提高DNA模板的沉淀。

1.6 PCR反應體系和參數[8]

Real-time PCR反應體系的總體積為25 μL，包括 SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.7 μL，DNA 模板 5.0 μL，ddH2O 5.6 μL。并按此順序加樣。用5 μL的ddH2O代替DNA模板作空白對照組。

Real-time PCR反應的條件為：95℃預變性30 s；95 ℃變性 5 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸10 s，40 個循環；72 ℃保溫 1 min。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌引物的特異性試驗

分別吸取沙門氏菌和非沙門氏菌標準菌株的DNA提取液6 μL作為模板，進行PCR擴增，

2.2 食品樣品中沙門氏菌的檢測

對經國標（GB/T 4789.4—2003）和普通PCR方法檢測都確認是沙門氏菌陰性的食品樣品，再用Real-time PCR方法進行檢測，記錄擴增曲線和熔解曲線。同時，用鼠傷寒沙門氏菌的增菌液吸取擴增產物5 μL進行電泳。由圖1，2可知，引物對沙門氏菌擴增產物的條帶清晰明亮，沒有拖尾和非特異性帶，而對非沙門氏菌擴增產物無條帶，與空白對照組效果一樣。因此，引物對沙門氏菌具有較強的特異性。按1.4的步驟作陽性對照。

2.2.1 市售熟制牛肉中沙門氏菌的檢測 對人工加入不同稀釋度菌液的牛肉進行平板計數及Real-time PCR檢測，結果如圖3，4所示。

圖3的熔解曲線中，陽性對照為鼠傷寒沙門氏菌。從圖3可以看出，牛肉中沙門氏菌濃度從1.3×107cfu/25 g到13 cfu/25 g均呈現一個典型的熔解峰，并且其熔解峰與陽性對照一致，擴增目標基因的熔點值Tm為85.602℃，說明Realtime PCR方法檢出的是沙門氏菌而非其他菌株，檢測結果為沙門氏菌陽性。同時，空白對照和沙門氏菌量少到2 cfu/25 g時，均未出現特異性的熔解峰，檢測結果為陰性。

擴增曲線如圖4所示，曲線拐點清楚，標準的基線平直，無明顯的上揚趨勢，表明各反應管的擴增效率相近，擴增比較好。由圖4可知，牛肉中沙門氏菌濃度從1.3×107cfu/25 g依次減少至13 cfu/25 g，擴增曲線的Ct值依次增加且都小于40，而2 cfu/25 g和空白對照組的擴增曲線與標準基線重復，即Ct值均為0，可見SYBR Green I Real-time PCR方法檢測牛肉中的沙門氏菌的檢出限為13 cfu/25 g。

由表2可知，用常規PCR方法檢測市售熟制牛肉中沙門氏菌的靈敏度為128 cfu/25 g，而用Real-time PCR方法檢測的靈敏度為13 cfu/25 g，靈敏度明顯高于常規PCR檢測方法。

表2 SYBR GreenⅠReal-time PCR與常規PCR的比較

2.2.2 市售香腸中沙門氏菌的檢測 對人工加入不同稀釋度菌液的香腸同時進行平板計數及Real-time PCR檢測。結果如圖5，6所示。

圖5的熔解曲線中，陽性對照為鼠傷寒沙門氏菌。從圖5可以看出，香腸中的沙門氏菌濃度從1.2×107cfu/25 g到12 cfu/25 g均呈現出一個明顯的熔解峰，并且其熔解峰與陽性對照一致，擴增目標基因的熔點值Tm為85.602℃，說明SYBR Green I Real-time PCR方法檢出的是沙門氏菌而非其他菌株，檢測結果為沙門氏菌陽性，其特異性比較強。同時，空白對照和鼠傷寒沙門氏菌量少到1 cfu/25 g時，均未出現特異性的熔解峰，說明檢測結果為陰性。

擴增曲線（圖6）中，樣品曲線與陽性對照的曲線整體平行性較好，曲線拐點清楚，標準的基線平直，無上揚趨勢，說明各反應管的平等性好，擴增效果比較好。由圖6可知，香腸中的鼠傷寒沙門氏菌濃度從1.2×107cfu/25 g依次減少至12 cfu/25 g，擴增曲線的Ct值逐漸增加且都小于40，而1 cfu/25 g和空白對照組的Ct值均為0，所以SYBR Green I Real-time PCR方法檢測香腸中的沙門氏菌的檢出限為12 cfu/25 g。

從表3可以看出，用常規PCR方法檢測市售香腸中沙門氏菌的靈敏度為116 cfu/25 g，而用Real-time PCR方法檢測市售香腸中沙門氏菌的靈敏度為12 cfu/25 g，靈敏度明顯高于常規PCR檢測方法。

表3 SYBR Green I Real-time PCR與常規PCR的比較

2.3 可重復性試驗

為驗證Real-time PCR方法的可重復性，以同一濃度的鼠傷寒沙門氏菌DNA為模板，做3個重復，分別進行同條件的擴增。結果（圖7）顯示，3個樣品的擴增曲線基本吻合，3次擴增曲線的 Ct值分別為 28.56，28.39，28.41。經計算，3 次擴增曲線Ct值的標準差為0.093，變異系數CV（coefficient of variation）為0.33%。而一般熒光PCR儀的Ct值重復性誤差在CV≤2.1%范圍內就可以[9]，可見，本試驗所研究的Real-time PCR方法具有較高的可重復性，從而保證了不同樣品間檢測結果的可靠性和穩定性。

2.4 抗干擾性試驗

在食品樣品中接種少量的鼠傷寒沙門氏菌菌液，再分別接種大腸埃希氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌等（接種量大于沙門氏菌），另外，作一組只接種相同量的沙門氏菌樣品為對照，用Real-time PCR方法進行檢測。經試驗，接種雜菌的待檢樣品中的沙門氏菌含量達到Real-time PCR方法的檢測靈敏度，因此，該方法不受其他雜菌的影響。

3 討論

Real-time PCR方法在普通PCR基礎上，增加了SYBR Green I熒光染料，在PCR擴增的同時檢測其熒光強度，可大大提高檢測的靈敏度。Real-time PCR方法采用完全封閉的管和熒光染料同步檢測，省略了PCR產物的電泳和紫外燈下觀測等步驟，簡化了檢測過程，節省了檢測時間。Real-time PCR方法還比較安全，整個體系中不包含EB等有毒物質，對環境的污染和人體的危害很小。本試驗建立了針對沙門氏菌的Realtime PCR檢測方法，其檢測時間（不包括增菌和前處理）僅需1.5 h。因此，該檢測方法快速、靈敏、穩定，且操作簡便，易于掌握[10-11]。

Real-time PCR具有上述諸多優點的同時，也存在一些不足之處。如Real-time PCR方法運用了封閉的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，因此也就不能監測擴增產物的大小[12]（本試驗先用普通PCR檢測，知道其擴增產物的大小，再用Real-time PCR方法提高其檢測的靈敏度，避免了這一不足之處）；熒光PCR儀價格較昂貴，從而限制了其廣泛的應用；熒光染料見光易分解，需要避光保存等。另外，它的特異性完全依賴于引物，并不比常規的PCR具有更高的特異性；熒光信號的強弱依賴于雙鏈DNA的質量而不是分子數[13]。在擴增效率相同的情況下，長擴增產物的信號要強于短擴增產物。如果擴增效率不同，那么定量會更不準確。從長遠看，尤其是對于檢測工作來說，熒光PCR技術將越來越得到廣泛的應用，成為病原菌檢測的主要技術之一。

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