植物PPDK基因在基因工程中的應用

王原媛，白云鳳，張定宇

（1.山西農業大學研究生學院，山西太谷030801；2.山西省農業科學院作物遺傳研究所，山西太原030031；3.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

1 PPDK基因的結構及其功能

在植物的C4代謝途徑和景天酸代謝途徑（Crassulacean acid metabolism，CAM）中存在一種叫作丙酮酸磷酸雙激酶（Pyruvateorthophosphate dikinase，PPDK）的限速酶。PPDK基因大部分位于植物的葉肉細胞中催化丙酮酸（Pyruvate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）。在細菌、原生動物等生物體中也均發現有PPDK酶存在，在這些生物體中PPDK起丙酮酸激酶的作用，催化丙酮酸和ATP生成的反應。原生動物、細菌與植物的一級結構十分相似，這種一級結構上的高度同源性說明在原核生物及真核生物分化之前，原始的PPDK基因就已經出現了（表 1）。

表1 原生動物、細菌與植物中PPDK基因的區別

在植物體內，丙酮酸磷酸二激酶首先以一個 大的前體蛋白形式在細胞質中被合成，并在葉綠體中加工為成熟的酶。PPDK基因的cDNA序列最先是由Matsuoka等人從玉米中克隆出來的，然后根據cDNA序列預測其氨基酸序列，這也是完整的PPDK蛋白一級結構的最早研究。玉米cDNA序列中包含有一個長2 844 bp的開放讀碼框，其分子量是編碼為947個氨基酸的多肽。

Matsuoka等人通過確定純化酶的N端氨基酸序列，結果表明，成熟的酶含有876個氨基酸殘基，轉運肽含有71個氨基酸殘基，從而確定了轉運肽的剪切。將PPDK酶的轉運肽與其他核基因編碼的葉綠體蛋白進行比較，結果顯示，PPDK轉運肽與1，5－二磷酸核酮糖酶小亞基及捕光復合體AB的轉運肽有3個區域較為相似，N端的氨基酸序列MAASV類似N端同源區MAXSX，中間序列TSFARRSV與小麥同源區II SSFAGKAV類似，第三段序列SGAGRGQHC與玉米1，5－二磷酸核酮糖小亞基轉運肽剪切位點附近序列SNGGRIRC類似。這些序列都位于各自肽鏈的相同位置，不過，PPDK轉運肽的長度比其他酶的轉運肽要長得多。

2 PPDK基因在C4循環和C3植物中的研究

2.1 C4循環中的PPDK基因

在植物體內的C4代謝途徑，植物以及PPDK的具體作用是催化一個可逆的三步反應，將ATP，Pi和丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。反應的第一步是將ATP的γ-磷酸及β-磷酸轉移到酶活性位點的組氨酸殘基上，第二步是將γ-磷酸轉移至磷酸，第三步將剩余的β-磷酸轉移到丙酮酸。總反應式如下:

丙酮酸＋腺嘌呤 -P-Pβ-Pγ+Pi→PEPβ+AMP+PPiγ+2H+

從PPDK蛋白的晶體結構中可以看出，其催化反應可能是在一個蛋白結構域中（包含通過核苷酸及丙酮酸結合結構域間的鉸鏈區盤曲折疊而成的活性位點）進行的。

C4循環途徑較C3途徑具有更大的優勢，其能在外界CO2濃度較低的情況下，通過它的酶系統（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）、NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）、NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）和丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）等[2]）保持高效的CO2同化率。其中，PPDK是C4植物光合反應中的一個葉綠體酶，同時是C4途徑的專一性酶，該酶催化CO2初級受體——磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的生成。該催化反應主要受到光的調控，是C4光合作用途徑的限速步驟之一。在C4植物的葉片中，丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）主要位于葉綠體的葉肉細胞氣孔中，C4植物在高光強和高溫的條件下，比C3植物具有更強的光合效率，在C4途徑中，由于CO2在維管束鞘細胞中濃縮，氧化（oxylase）受到抑制或者停止，以至于光呼吸可以忽略。

2.2 PPDK基因在C4途徑的酶分子生物學中的研究

隨著C3植物中C4途徑存在的證實及分子生物學手段的運用，人們更深刻地了解C4途徑酶類的分子機理及它們在C3植物體內的表達。Agarie等認為，PPDK在一種兩棲類植物荸薺（Eleocharis）體內表達的研究是近年來研究最為成功的例子。在陸生環境下，荸薺進行C4循環途徑，但在水生環境下，荸薺進行C3方式的循環途徑。通過研究丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的同源（分別為陸生和水生環境下）基因PPDK 1和PPDK2，證明了盡管基因PPDK1和PPDK2同源性很高，但卻不完全相同。PPDK1和PPDK2分別編碼一個葉綠體PPDK和一個細胞質PPDK。原因在于PPDK1蛋白是由cDNA的核序列編碼，且包含一個特殊的N端區域，可能作為葉綠體的轉移肽，然而PPDK2缺乏這個特殊區域。核DNA編碼的PPDK基因，其細胞專一性表達是在轉錄水平上調控的，PPDK1和PPDK2從2個不同的起始點轉錄。在2個不同的起動子的控制下，大的轉錄產物是葉綠體PPDK，包括轉運肽；小的產物是細胞質PPDK。基因組的Southern印跡結果表明，在荸薺的基因組中存在小的PPDK基因家族。基因組的Northern印跡結果表明，荸薺的葉綠體PPDK1和細胞質PPDK2都是在其空心稈（荸薺的光合器官）中表達，但是這些基因的表達隨著荸薺處于生態環境條件的不同而不同。當荸薺在陸生環境中時，其空心稈具有Kranz結構并以C4循環途徑進行光合作用；當荸薺在水生環境中時，其空心稈以C3循環途徑進行光合作用。

2.3 C3植物中的PPDK基因

C3植物中是否存在C4光合途徑一直受到很多科研人員的關注，在C4植物葉片中有特殊的Kranz結構。有研究顯示，C4植物是從C3植物中分化出來的，而且這種轉變在進化上是多源的。Sheen認為，C4型PPDK基因在C3植物中可能有一個祖先，含有一個類似于C4型基因的結構，通過引入第一外顯子——一個編碼非常重要的轉入葉綠體的轉運肽而成為C4基因。但是目前已經發現，在水稻等C3植物中的PPDK基因與C4型的PPDK基因一樣，也具有2個不同的啟動子轉錄的不同起始位點。在水生植物Hydrilla verticilata[3]和 Egeria densa[4]中沒有 Kranz 結構，但是卻存在C4光合途徑的運行，說明在植物葉片的單一光合細胞中可以進行C4光合微循環。早有報道，在 C3作物大豆[5]、小麥[6]、水稻[7]葉片中有 C4光合酶系統，由于酶活性較低，因此提出C3植物葉片中可能具有有限的C4光合途徑。Chen等[8]研究指出，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產物OAA或MA，可提高葉片的光合能力，這為在C3植物中建立C4微循環系統以提高光合效率的可能性提供了依據[9]。

Aoyagi等證實，在C3植物中存在著與C4植物同樣的丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）。已有報道，C3植物中的PPDK與C4植物中的PPDK具有相同的酶學特征，如被光激活、對冷脅迫的敏感，催化性質等。Hata以及Aoyagi等證明，PPDK不但存在于葉綠體中，而且還存在于小麥種子的細胞質中，Imaizumi通過Northern blot分析發現，在水稻種子的細胞質中有PPDK的存在。PPDK大部分位于葉肉細胞，它的活性已在C3植物的光合組織中被測定。Hata等發現，C3植物水稻幼苗體內的PPDK與C4植物玉米的PPDK無論在蛋白分子量，還是抗原決定簇和蛋白質結構等方面都相同。

3 PPDK基因在植物基因工程領域的應用

3.1 轉基因煙草植株中PPDK基因與鋁脅迫的關系

將C3植物冰葉日中花（M crystallinum）的PPDK基因轉入煙草的基因組中，轉基因的煙草就能通過根部有機酸的分泌來抵抗鋁的脅迫。在高等植物的細胞質和葉綠體中，PPDK基因的表達水平受干旱和鹽脅迫的影響。通過在轉錄水平對patatin基因家族B33啟動子的調控，生產出表達冰葉日中花PPDK或者ΔPPDK的轉基因煙草植物并發現它們可以改善鋁的脅迫。在轉基因植株中，當受到鋁脅迫時根的生長加強；然而在野生的植株中根的生長卻被強烈地抑制。通過ECR染色和原子吸收光譜測定，在轉基因植株根尖鋁的含量要比野生植株含量低。此外，轉基因植株所產生的三羧酸循環中間產物（檸檬酸和蘋果酸）要比野生植株高。通過對ECR根染色、有機酸分泌和鋁積累的研究發現，2種轉基因植物相比，含有PPDK基因的植株比表達ΔPPDK基因的植株對鋁脅迫有更強的耐受力[10]。

3.2 PPDK轉基因水稻的研究進展

隨著科學技術特別是分子生物學方面的發展，目前已成功將磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）、NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）轉到水稻中獲得了5種轉基因水稻。Schreiber等[11]將已導入玉米C4光合關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、丙酮酸磷酸 二 激 酶 （PPDK）、NADP- 蘋 果 酸 酶（NADP-ME）和PEPC+PPDK的轉基因水稻為材料，以其受體品種Kitaake（WT）為對照，對C4轉基因水稻秧苗葉片氣孔與葉鞘維管束的結構特征進行研究，結果表明，品系葉片上的氣孔密度最高，其氣孔總面積（是對照的1.47倍）在轉基因品系中也是最高，轉基因PPDK品系水稻秧苗干質量明顯高于對照品種，其葉片的類囊體結構也比對照品種更完整、有序，有利于光能轉換，但是其葉鞘維管束組織卻不如對照發達。綜合以上結論，PPDK仍然具有轉基因水稻高光效表達的結構基礎。季本華等[9]利用亞硫酸氫鈉對轉PEPC基因水稻葉片進行噴施，發現其凈光合速率的增加幅度較大。

3.3 PPDK轉基因秈稻IR64的研究進展

在具有增加20倍光合作用酶活性的轉基因水稻中，C4基因對C3植物水稻的生理沖擊是很小的，沒有觀察到水稻光合作用特征的改變。張建福等研究的玉米高光效基因PPDK在秈稻IR64中的整合及其與光合作用相關的特性分析表明，丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的反應是逆向的，依賴于底物、活化劑和非活化劑的濃度。這可能是丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的過量表達不能導致轉基因水稻葉片碳代謝顯著效應的原因。盡管是初步的結論，但丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的過量表達可以增加每叢轉基因水稻植株的粒數和千粒質量。對轉基因IR64植株的分析結果表明，轉基因IR64植株劍葉的全氮含量比非轉基因IR64植株高，說明玉米丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）基因能夠促進轉基因IR64植株對土壤中氮的吸收和同化，而且在溫室條件下，大部分轉基因IR64植株的結實率和收獲指數高于非轉基因植株[12]。

3.4 大豆中PPDK基因的研究進展

Li等[5]研究大豆葉片C4循環途徑酶表明，不同發育時期大豆葉片內均存在PPDK酶作為C4途徑的再生磷酸烯醇式丙酮酸的特定酶PPDK，其變化趨勢是從苗期到初莢期酶活性逐漸升高，然后降低。在初莢期，PPDK酶活性均達到最高值。

4 展望

目前，已經明確了植物PPDK基因是C4植物的限速酶之一，對植物光合效率的提高有至關重要的作用，而且已經成功運用植物基因工程將C4植物的PPDK基因導入C3植物中，但PPDK基因的許多優勢作用目前尚未明確，所以，運用包括分子生物學在內的各種方法，研究PPDK對光合作用、植物抗性等的具體影響方式，并將其優勢功能運用于其他農作物，將會成為今后一個重要的研究方向。

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