誘導MSCs轉分化為視網膜神經樣細胞的應用

白 月 徐國興 莊 華 謝茂松 郭 健 王婷婷

誘導MSCs轉分化為視網膜神經樣細胞的應用

白 月 徐國興 莊 華 謝茂松 郭 健 王婷婷

福建醫科大學附屬第一醫院,福建省眼科研究所

近年來，人們研究發現骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在體外可經生長因子誘導，抗氧化劑誘導，中藥誘導，增加細胞內cAMP等不同途徑的誘導方法，分化為神經外胚層來源的神經元及神經膠質細胞，因此一些研究者嘗試以上誘導途徑使MSCs分化為視網膜神經樣細胞，用于體內相關疾病的細胞替代治療，為多種疾病帶來了新的治療思路。

骨髓間充質干細胞 體外誘導 視網膜神經樣細胞

胚胎干細胞具有發育全能性，理論上可誘導分化為機體所需的任何組織或器官，但涉及倫理學問題，以往受到很大限制，發展緩慢。應用眼色素上皮緣的視網膜干細胞[1]及鼠腦神經先祖細胞移植[2]也由于供體組織有限性及安全性問題，不利于治療視網膜疾病的開展。于是有人把目光投向成體干細胞中的MSCs，成年動物骨髓有2類干細胞群：造血干細胞和間充質干細胞。最初因其容易貼壁呈成纖維細胞樣克隆生長，被稱為成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）[3],后來研究發現它是骨髓造血微環境的重要組成部分，在體內外均具支持和調控造血的作用，且具有多向分化潛能，故又稱其為間充質干細胞[4]。也稱為骨髓基質細胞[5]。

MSCs的特點為:①來源于中胚層，可以跨系統甚至跨胚層分化為3個胚層來源的細胞，特別是中胚層和神經外胚層來源組織的細胞（視網膜來源于胚胎期神經外胚層），并且經過20~30次細胞分裂后，這種分化特性也不會消失[6]。②分離培養方便。③由于不表達T細胞識別的細胞表面標志，植入后不會發生免疫排斥反應。④易于轉染和穩定高效表達外源基因優點[7],因此可把利于定向分化的生長因子基因轉入MSCs，促使其定向分化。

MSC的純化方法有貼壁篩選法，流式細胞儀分選法，密度梯度離心法，免疫磁珠法。如果能找到更特異性標記物，就可以獲得更純的MSCs，這對后續的實驗步驟所得的實驗數據有重要影響。

MSC為中胚層來源的干細胞，難于使其直接定向分化為外胚層來源的視網膜神經細胞[8]，而且MSC直接移植后只有少量細胞能分化為視網膜神經細胞，因此要通過MSC獲得神經干細胞，再分化為神經前體細胞，進一步分化為成熟的神經細胞。Nestin抗體（巢蛋白）為神經干細胞的特異性抗體，而MAP-2抗體為成熟神經元特異性標志。

MSC表達許多生長因子和細胞因子受體以及細胞與細胞黏附作用的受體，提示MSC的功能受自分泌和旁分泌循環的調控。這成為不同方法誘導MSCs定向分化的理論基礎。目前，體外誘導MSCs向神經樣細胞分化有4種方法：生長因子誘導，抗氧化劑誘導，中藥誘導，增加MSCs內cAMP誘導。

1 生長因子誘導方法

Sanchez-Ramos等[9]將BMSC（Bone marrow stromal cells）用10ng/mLEGF預誘導，再用腦源性神經生長因子（BDNF）誘導，見其表達巢蛋白（nestin）。同時也表達GFAP和 NeuN.當將人或鼠的BMSCs與小鼠的中腦細胞或紋狀體細胞共培養，結果有很小比例（0.2%~5%）MSCs表達神經膠質細胞標記物-神經膠質元纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神經元標記物-神經元特異核蛋白(Neuron-specific nuclear protein,NeuN)。這種方法常用于誘導分化為視網膜神經樣細胞的研究。

張卉以含有堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）或表皮生長因子 (EGF)加bFGF，或bFGF、EGF加全反式維甲酸(ATRA)的培養液培養BMSCs, 經誘導物誘導72 h后 , 纖維連接蛋白（fibronectin）和 I型膠原（collagen I）免疫陽性細胞減少。轉化為神經干細胞（NSC）的nestin免疫陽性細胞增多。7d后其又減少。細胞分化后, 分化為神經元（神經元特異烯醇化酶-NSE）的陽性細胞最多占細胞總數的24.76%±2.72% ,同時分化為神經膠質細胞的GFAP陽性細胞占細胞總數的36.58%±3.26%[10]。bFGF參與骨髓MSC向神經分化的啟動[11]，同時bFGF又可促使神經前體細胞對EGF產生反應，兩者聯用有明顯的協同作用，發揮增殖效應[12]。從胚胎發育的過程來看，EGF及其受體出現要比bFGF晚，研究表明EGF多促進MSCs向膠質前體細胞分化，而bFGF主要對神經元前體細胞的分化有促進作用[13，14]。

有人在MSC培養基中加入神經膠質生長因子（glial growth factor,GGF）,觀察其可以向神經膠質細胞分化，并表達GFAP。

Anthony等應用activinA（活化蛋白A），牛磺酸和EGF對成人CD90+MSCs體外誘導分化后，20%~32%的細胞表達感光細胞特異標志——視紫紅質，視蛋白，recoverin(恢復蛋白)[8]。受此實驗啟發，可知在不同的化學誘導條件下，MSCs可能分化為不同類型的視網膜細胞。

孫旭芳等[15]用DMEM/F12(含10%FCS胎牛血清和100u/mL P/S) 1:1添加0.6%葡萄糖，1×ITS（胰島素-轉鐵蛋白-硒化物，insulin transferring selenium）,2mM谷酰胺，3mM碳酸氫鈉，20ng/mLEGF,20ng/mLbFGF,5mMHepes制成分化液Ⅰ誘導6~10代rMSC14天后，檢測其高表達神經干細胞特異性標志物nestin。培養視網膜神經細胞, 收集視網膜細胞培養上清液加入10%的FCS,與視網膜神經細胞培養液按照1:1混合，制成分化液Ⅱ，使形成的神經球形體在模擬眼內環境誘導下分化出視網膜神經樣細胞，48h用免疫熒光檢測，部分細胞NeuN,Thy1.1染色陽性（Thy-1位于哺乳動物RGCs.Thy-1.1抗原僅表達在大鼠神經節細胞上，用于鑒定大鼠RGCs），少數細胞表達GFAP。

牟大鵬等[16]先把分離到的視網膜組織加入DMEM培養液并用阿糖胞苷（Ara-C以抑制非神經細胞的增殖后）處理后，將視網膜神經細胞培養液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，真空抽濾后按2:3比例與DMEM培養液混合后誘導分化2~4代的rMSCs,2d后即可見神經元樣細胞出現，7d神經元樣細胞占細胞總數的26~27%，免疫熒光檢測β–tubulinⅢ（又稱微管蛋白是RGCs早期和成熟期的標志物）陽性為18%±3%，Neurofilament protein(NF，神經絲蛋白，是神經元的特異性標志物)陽性率為23%±4%，3天后免疫組化Nestin陽性數為30.9%±7.7%，MAP-2染色陽性。

在視網膜神經細胞上清液制成的微環境中，視網膜神經細胞產生的細胞外基質如各種糖蛋白，粘蛋白，各種神經營養因子，各種細胞因子等可以維持骨髓源性神經干細胞生存，并向特定的視網膜細胞分化的良好環境。

bFGF誘導方法是誘導BMSCs向神經元方向分化的經典方法[17]，其優點在于可以獲得較多的神經元樣細胞。劉東寧等[18]先用含10ng/mL bFGF的DMEM/F12(10%FBS)預誘導24h,再加入DMEM/F12,10ng/mL bFGF,2%二甲基亞砜，200umol/L丁羥茴醚，10umol/L福斯高林，5mmol/L KCl,2mmol/L丙戊酸，5ug/mL胰島素的神經誘導基誘導第3代BMSCs7天。免疫化學鑒定1~7d可見神經元樣細胞MAP-2(抗微絲微管相關蛋白-2)74.2%，Thy1.1陽性，GFAP陰性。也說明bFGF誘導后細胞主要向成熟神經元方向分化，而不是神經膠質細胞。bFGF誘導雖然可以獲得較多的成熟神經元，但難以長期存活，聯合其他神經營養因子如腦源性神經生長因子進行維持培養，有利于誘導后神經元的長期存活。

BMSCs與新生鼠視網膜神經細胞共培養后可分化為RGCs(retinal ganglion cells,視網膜神經節細胞)特異性抗體Thy1.1表達陽性的細胞[19]。利用出生1~3d的乳鼠視網膜細胞作為誘導劑置于Transwell雙層培養板的上層使未成熟的視網膜組織內促進原始視網膜干細胞分化和發育的細胞因子，受體(BDNF,NGF,TrkB受體等)及細胞外基質成分，通過上層濾膜孔擴散至下層BMCs周圍，模擬了原始視網膜發育的微環境。本實驗說明BMSCs經化學性誘導和視網膜神經細胞共培養誘導均可特異性分化為具有RGCs表型的細胞。

一些體外實驗還證實，還有許多因子調節MSC的分化方向，如胰島素樣生長因子Ⅰ(insulinlike growth factorⅠ,IGFⅠ)和腦源性生長因子(brain-derived growth factor,BDGF)被證實支持神經元方向分化。而睫狀神經營養因子（ciliary neurotrophlic factor,CNF）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）作用于多潛能MSC,誘導它們分化成星形膠質細胞.

2 抗氧化劑誘導

活性氧(ROS)是氧分子還原成水時產生的許多活性中間體的統稱,包括過氧化氫(H2O2/超氧陰離子(O2ˉ)/羥自由基(·OH)等。有學者證實[20]抗氧化劑可上調細胞P53基因轉錄表達的同時可下調c-myc基因的表達，從而調控細胞周期誘導干細胞分化。

Woodbury 等[21]報道,將鼠和成年人的MSCs先用2-巰基乙醇（ME-2）的DMEM/FBS誘導，以啟動MSCs的神經細胞分化，接近80%出現神經細胞的表型和表達神經細胞標志性蛋白NSE（神經元特異性烯醇化酶）,NF-M（神經絲蛋白）,NeuN（神經元特異性核內抗原）。進一步用二甲亞砜，丁羥基苯甲醚，叔丁基對甲氧酚的DMEM中誘導，一周內超過50%的MSCs出現神經細胞形態學的改變，且以神經元標記物NSE，M-神經絲或Tau增高為主。

項鵬等[22]分別采用含巰基乙醇和硫代甘油等試劑的無血清DMEM誘導MSC分化為神經元，結果示誘導24小時,MSCs中約75.5%的NSE 陽性而GFAP陰性。賈延劼等[23]在β-巰基乙醇預誘導MSCs 24h ,再誘導5h, NSE表達率為 (63.7±4.5 ) %。

3 中藥誘導

肖慶忠等[24]采用含100 ~ 150mg/L麝香多肽的無血清L -DMEM培養基誘導成年大鼠和人BMMSCs分化為神經元，免疫組化顯示神經元樣細胞NSE（93.5%）,NF（88.2%）,nestin表達陽性，GFAP陰性。

項鵬等[25]分別采用含丹參注射液或硫代甘油等試劑的無血清達樂伯克改良必需基本培養基 (DMEM)誘導MSC分化為神經元。與傳統的誘導分化劑硫代甘油相似，但細胞存活時間較久。

撒亞蓮[26]用三七總皂甙和賈延劼等用黃荃甙誘導MSCs,均得到同樣的結果。此外,黃芪、天麻、人參、當歸、腦新舒、人參蜂王漿多種傳統中藥成分及中藥制劑體外均能誘導大鼠分化為神經元樣細胞[27]。

4 增加MSCs內cAMP誘導其分化

可從基因水平上，誘導MSCs沿著特定的路徑增殖發育成各種神經細胞。

Deng weiwen等[28]發現未分化的hMSCs可表達一些神經細胞的標志物，如微管蛋白(TuJ-1，neuron-specific tubulin), 神經元特異性烯醇酶（NSE），微管相關蛋白(MAP1B，microtubule-associated protein 1B)及波形蛋白(vimentin)。在培養基內加入誘導劑0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IMBX，isobutylmethylxanthine)和1mM cAMP類似物雙丁酰環磷腺苷(dbcAMP，dibutyryl cyclic AMP)，誘導6天,約有25%的MSCs 分化為典型的神經細胞形態, NSE 和 vimentin表達增高,且這種分化是不可逆的。提示：在體外，通過增加細胞內cAMP水平，可使MSCs分化為早期的神經前體細胞。

項鵬、夏文杰等[29]采用含腺苷酸環化酶激動劑Forskolin及磷脂酶抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的無血清DMEM誘導MSC分化為神經元。

5 幾種誘導因素的比較

對以上幾種誘導因素綜合比較可用增加胞內cAMP使MSCs分化為神經前體細胞，用抗氧化劑誘導MSCs分化為神經細胞，用生長因子誘導途徑分化為神經膠質細胞或神經元細胞。此外應用中藥誘導也不失為一種可行方法。雖然后三種方法還未應用于誘導MSCs分化為視網膜神經樣細胞，但卻展示了其良好的發展前景。

6 問題與展望

不僅是不同誘導途徑的差別，在MSCs培養，MSCs表面標志的檢測，視網膜神經細胞的培養，MSCs向視網膜神經樣細胞的分化，每一個環節都會影響免疫組化和RT-PCR監測到的陽性率。影響MSCs向神經細胞分化的因素比較復雜：有內源性因素，如細胞質對核的影響；外源性因素，如相鄰細胞的相互作用；細胞外環境因素：如細胞因子，激素等。而且這些因素如何起作用的機制不清，還需從形態特征，超微結構，分子生物學，生理學等角度進一步研究。不能急功近利的在短期內制備出完美的微環境，只能以體外一次次分析每個誘導因素的作用，逐漸完善模擬的微環境。誘導后的細胞是否具有視網膜神經細胞的一系列功能還不是完全清楚。并且對這些因子的研究大多是在體外排除其他因素影響的情況下進行研究的，而在體內則是通過相互作用起效應的，如何發揮多種因子協同作用，仍待解決。

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福建省重點科研課題（基金編號：2008Y0040）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。