茭白黑粉菌的分離鑒定研究

趙海偉 鄒克琴 葉子弘 尤文雨

（中國計量學院生命科學學院，浙江 杭州 310018）

茭白（Zizania latifolia（Griseb.））又名菰，是我國南方的一種水生蔬菜[1]。在太湖一帶的浙江和江蘇有大量栽種。在自然界中菰黑粉菌（Ustilago esculenta P.Hennings）屬于其內生真菌，其與茭白共生，主要分布在茭白莖中[2]。菰黑粉菌生活在茭白莖中，抑制茭白開花結實，刺激茭白莖部膨大，茭白膨大的莖部可供食用[3，4]。關于茭白孕茭的生理變化國內有報道[5]，但是茭白和黑粉菌如何互作調節(jié)其莖部的發(fā)育的分子機制仍然不清楚。本文通過分離灰茭中的黑粉菌并進行鑒定研究，為探索茭白莖發(fā)育的調控機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

“余茭4號”灰茭，于2007年11月采自浙江省農業(yè)科學院。

1.2 試劑

Taq酶，dNTP均購自博日科技有限公司；pMD18-T Vector購自大連寶生物公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和大腸桿菌DH5α均購自天根生化科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 菰黑粉菌的分離和培養(yǎng)

將“余茭4號”灰茭用流水沖洗，再用蒸餾水洗凈晾干，在超凈工作臺上用75%酒精擦拭表面，用無菌小刀橫向切開，用接種環(huán)挑取黑色的孢子于1mL無菌水中混勻，取50μL涂布于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。

1.3.2 黑粉菌的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)鑒定

待PDA固體培養(yǎng)基中長出單菌落后，肉眼觀察菌落形態(tài)，同時用牙簽沾取單菌落置于無菌水中，取10μL菌液顯微鏡下觀察。

1.3.2.2 菰黑粉菌的分子鑒定

(1)黑粉菌總DNA的提取

挑取單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在搖床中以130r/min，28℃恒溫震蕩培養(yǎng)。第7天取培養(yǎng)液20mL，8000r/min室溫離心2mins，取菌體，參照吳志紅等[6]方法提取菌株基因組DNA。

(2)ITS-5.8S rDNA-序列的PCR擴增

應用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增其ITS5.8S rDNA。上游引物ITS1序列為：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，下游引物ITS4序列為：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC，引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系為：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs Mixtur 4μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μl，DNA template 1μL，Taq 酶 1μL，加 ddH2O到50μL。PCR 反應條件為 94℃ 5 min，94℃30s，50℃ 30s，72℃ 1min，30 個循環(huán)，72 ℃延伸10min。

(3)瓊脂糖凝膠電泳

取3μl PCR擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠孔內進行電泳,用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并照相。

(4)克隆測序及序列分析 用DNA回收試劑盒回收純化目的DNA。將目的基因與pMD18-T載體連接,連接產物轉化感受態(tài)細菌DH5α，在37℃培養(yǎng)12-14h后，用藍白斑篩選的方法,挑取白色單菌落,PCR鑒定該單菌落確實含有目的基因后,將菌液送至上海英駿生物技術有限公司進行序列測序，測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST，并進行同源性比較。

2 結果

2.1 菰黑粉菌菌體形態(tài)觀察

在PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，菌株形成單菌落，背面和正面均為白色，大小1-3 mm，。培養(yǎng)7-10后，單菌落逐漸變大，形狀為不規(guī)則圓形，波狀，中間隆起或有脊狀突起，單菌落顏色由白色逐漸變黃，且隨培養(yǎng)時間的延長而加深（圖1）。

圖1 黑粉菌在平板上的形態(tài)

圖2 菰黑粉菌ITS-5.8SrRNA序列擴增圖

M:DNA marker(從上到下大小：2000bp,1000bp,700bp,500bp,200bp,100bp)Lane1-2:菰黑粉菌PCR

2.2 PCR擴增結果

取3μl PCR擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠孔內進行電泳。擴增片段大小為775bp，結果見圖2。

2.3 黑粉菌5.8SrRNA的分子進化樹分析

“余茭4號”灰茭黑粉菌ITS-5.8SrRNA序列經(jīng)測定后提交至GenBank，登錄號為FJ527029。根據(jù)ITS-5.8SrRNA序列，構建菰黑粉菌（FJ527029）和黑粉菌屬其他31個不同種發(fā)育樹，見圖3。從發(fā)育樹上可以看到有5個明顯的類群（圖中豎線），而分離出的黑粉菌（Ustilago esculenta）是黑粉菌屬的邊緣物種。

圖3 ITS5.8SrRNA序列的黑粉菌屬發(fā)育樹

3 討論

真菌的鑒定主要從真菌的孢子形態(tài)、菌落特征、生理生化特征等方面進行。按照這種傳統(tǒng)的方法鑒定真菌需要較長的時間和繁瑣的生化鑒定過程。隨著分子生物學鑒定手段運用到真菌的分類鑒定中，真菌5.8S rDNAITS區(qū)域是一段穩(wěn)定、保守而又具有種間特異性的基因區(qū)域，可以針對該區(qū)域設計特異性引物進行真菌的分子鑒定。本研究結合菌落形態(tài)和分子生物學手段對菰黑粉菌進行了成功鑒定。采用真菌通用引物ITS1和ITS4成功擴增了菰黑粉菌的ITS-5.8S rDNA區(qū)段，所測序列與NBCI上公布的菰黑粉菌同源性達到100%。

[1].陳守良,徐克學.菰屬 Zizania L.植物的分支分類研究[J].植物研究,1994,14(4）:385-394.

[2].柯衛(wèi)東，孔慶東.茭白肉質莖形成的初步研究[J].長江蔬菜，1996，（12）：23.

[3].Chan,Y.S.and Thrower,L.B.,The host parasite relationship between Zizania caduciflora Turcz.and Ustilago esculenta P[J].Henn New Phytol,1980,85:201-233.

[4].韓秀芹.茭白黑粉菌生物學特性的研究[M].2004,揚州大學碩士學位論文.

[5].張聶，壽森炎.茭白孕茭的生理變化研究[J].浙江農業(yè)科學,2006,6:613-617.

[6].吳志紅,汪天虹,黃衛(wèi).簡便易行的絲狀真菌染色體DNA提取法[J].菌物系統(tǒng)；2001,11(2):38-39