反相高效液相色譜法測定犬血漿中靛玉紅的質量濃度

童立年

(浙江省舟山醫院，浙江 舟山 316000)

靛玉紅是從中藥青黛中提取的雙吲哚類化合物，對慢性粒細胞白血病具有明顯的抑制作用[1-3]，具有臨床療效可靠、毒副作用小、對骨髓無明顯抑制作用等特點。筆者以非那雄胺為內標，建立了靈敏的反相高效液相色譜法測定Beagle犬血漿中靛玉紅的含量，旨在為靛玉紅的藥代動力學研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

2010 C型高效液相色譜儀(日本島津);BP 210 S型萬分之一電子天平(德國賽多利斯);TGL 216 C型臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠);XW-80型旋渦混合器(上海醫科大學實驗儀器廠)。靛玉紅對照品(中國藥品生物制品檢定所);非那雄胺(武漢合中化工生物有限公司);甲醇(色譜純，美國Fisher公司);水為重蒸水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

稱取靛玉紅對照品及非那雄胺適量，分別用二甲基亞砜(DMSO)和甲醇溶解制備成約含靛玉紅80 mg/L及非那雄胺100 mg/L的對照品貯備液，將上述兩種溶液貯存于-4℃冰箱中，臨用前用甲醇稀釋至所需質量濃度。

2.2 血樣制備與測定方法

精密量取Beagle犬血漿樣品0.5 mL，加入甲醇50 μL及內標非那雄胺甲醇溶液50 μL，旋渦混勻，加入混合溶劑正庚烷-乙醚(75 ∶25，V/V)3.5 mL，旋渦 5 min，以 10000 r/min 離心 5 min。分取有機相于另一離心管中，于50℃水浴中以氮氣流吹干。殘渣用100 μL流動相復溶，旋渦 3 min，以 10000 r/min離心 2 min。取上清液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，以內標法計算血漿中靛玉紅的質量濃度。

2.3 色譜條件與專屬性考察

色譜柱:Hypersil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測波長:286 nm;流動相:0.1 mol/L的醋酸銨(含0.5%冰醋酸)-甲醇(25∶75);流速:1 mL/min;柱溫:35℃。在此條件下，靛玉紅出峰時間在11 min左右，內標出峰時間在6 min左右;主峰和內標峰峰形良好，相鄰物質峰間可完全分離(R＞1.5)，血漿中內源性成分對測定無干擾，滿足樣品分析檢測要求。色譜圖見圖1。

2.4 分析方法驗證

圖1 高效液相色譜圖

線性范圍、檢測限及定量限:取0.5 mL空白犬血漿，分別加入不同質量濃度的靛玉紅對照品溶液和內標溶液50 μL，使每1 mL血漿中分別含靛玉紅 0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 μg/mL，混勻后依法萃取、測定，記錄色譜圖。以峰面積比(A樣/A內)為縱坐標、靛玉紅質量濃度 C(g/mL)為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線方程 Y=1.013 X+0.027，r2=0.9997(n=7)。結果表明，靛玉紅質量濃度在0.010～0.800 μg/mL范圍內與峰面積比線性關系良好，最低檢測限為5 ng/mL(S/N≥3)，最低定量限為10 ng/mL。

萃取回收率:取空白犬血漿0.5 mL，依法分別配制成高、中、低3 種質量濃度(0.400，0.100，0.025 μg/mL)的靛玉紅血漿樣品(C r)，按2.2項血漿樣品制備法處理后進樣3次，測得峰面積，并求出各質量濃度下3次進樣的峰面積均值 A r。另取高、中、低已知質量濃度(C s)的靛玉紅對照品甲醇溶液，氮氣揮干，加入100 μL流動相溶解后進樣20 μL測定，得峰面積 A s。以前后兩種處理測定得到的對照品峰面積之比(A r/A s)計算萃取回收率。結果平均萃取回收率為71.65%，RSD為6.78%(n=9)。

精密度及方法回收率:取空白犬血漿0.5 mL，分別配制高、中、低3種不同質量濃度的血漿樣品，照2.2項下方法分別在同一日內測定5次和每日5次連續測定3 d，考察日內、日間精密度和回收率。結果見表1。

表1 精密度和方法回收率試驗結果(n=5)

樣品穩定性:取空白犬血漿0.5 mL，分別配制高、中、低3種不同質量濃度(0.400，0.100，0.025 μg/mL)的血漿樣品，于冰箱 -20℃放置，在不同時間取樣，按2.2項下方法進行穩定性考察。結果血漿樣品中靛玉紅在15 d內穩定。

3 討論

關于靛玉紅血藥濃度的測定方法文獻報道很少。李長玲等[4]采用放射性標記法，但操作復雜，設備要求高，且測定結果實為靛玉紅及其代謝產物的放射性之和。李珂佳等[5]用丙酮直接沉淀蛋白的方法對大鼠血漿中靛玉紅質量濃度進行了測定，但定量限為0.025 μg/mL。筆者所建立的反相高效液相色譜法，通過對犬空白血樣的干擾分析、內標物質的選擇以及色譜條件與操作方法的研究，提高了靈敏度，方法學考察結果顯示能滿足生物樣品測定的要求，這為靛玉紅進一步的藥代動力學研究奠定了基礎。

[1]劉 佳，曾 琛，胡蘭萍，等.靛玉紅對慢性髓性白血病K562細胞增殖的抑制作用[J].中醫藥導報，2009，15(2):10-12.

[2]吳琦瑋，葛忠良，高 月，等.靛玉紅對腫瘤細胞抑制作用的研究及相關機制探討[J].天津中醫藥，2008，25(1):55-58.

[3]吳正紅，周 靜，平其能，等.靛玉紅磷脂復合物的跨膜轉運及其犬體內藥代動力學[J].中國藥科大學學報，2007，38(4):327-331.

[4]李長玲，籍秀娟.靛玉紅及其乙基和十八烷基衍生物在動物體內命運的比較[J].藥學學報，1983，18(5):332-338.

[5]李珂佳，蔣學華.RP-HPLC測定大鼠靜脈注射靛玉紅后的血藥濃度[J]. 華西藥學雜志，2007，22(3):333-334.