恰瑪古蜜膏對小鼠免疫功能的影響

孫 艷 ，安熙強 ，馬 媛 ，張 濤 ，姚 華 ，賈鴻雁 ，張亞輝

（1.石河子大學藥學院，新疆石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆烏魯木齊 830004；3.新疆柯坪圣泉實業有限公司，新疆烏魯木齊 830000）

恰瑪古（蕪菁，Brassica campestris）是一種草本十字花科植物，又稱蔓箐、狗頭芥等。《中國中草藥大全》、《維吾爾藥志》、《中華人民共和國衛生部藥品標準（維吾爾藥分冊）》等對恰瑪古的植物來源、藥材性狀、化學成分、藥理作用等都有詳細記載。恰瑪古為一種無毒副作用的植物，具有性溫排毒、提高機體免疫功能、促進消化、清肺、消腫、降血脂、抗癌等藥理作用[1]。恰瑪古蜜膏由恰瑪古和蜂蜜為主要原料制成，本文通過實驗研究對其在調節機體免疫功能方面的作用進行初步探討，為進一步開發其藥用價值提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明種小鼠，雌雄兼用，體重18～22 g，均由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號[新醫動字（新）syxk2003-0001]。

1.2 受試樣品與試劑

1.2.1 受試樣品 恰瑪古蜜膏，棕黃色，膏狀，成人每次20～50 g，每天3次，由新疆柯坪圣泉實業有限公司研制（批號20090203）。

1.2.2 試劑 二硝基氯苯（DNCB）（天津市光復精細化工研究所，批號20070421）；丙酮（天津市科密歐化學試劑開發中心，批號20060301）；麻油（新疆馨泉投資有限公司，批號20080204）；印度墨汁（Solarbio試劑公司）；硫化鋇（西安化學試劑廠，批號051022）；碳酸鈉（天津市盛淼精細化工有限公司，批號070520）；生理鹽水（新疆制藥廠，批號 07110721）。

1.2.3 試液配制 4%Giemsa染液（姬姆薩染料1.0 g、甘油66.0 ml、甲醇 66.0 ml）；Alsever溶液（葡萄糖 4.10 g，檸檬酸鈉 1.60 g，氯化鈉0.84 g，蒸餾水200 ml，無菌過濾）；都氏試劑（碳酸氫鈉 0.500 g，氰化鉀 0.025 g，高鐵氰化鉀 0.100 g，蒸餾水500 ml）。

1.3 實驗儀器

SP-752分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；80-2離心機（江蘇省金壇市醫療儀器廠）；顯微鏡CH30（日本OLYMPUS產品）；立式壓力蒸氣滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

1.4 方法

1.4.1 恰瑪古蜜膏對二硝基氯苯誘導的小鼠遲發型超敏反應（DTH）的影響[2-4]選取昆明種小鼠40只，體重18～22 g，按性別、體重隨機分為4組，分別為模型對照組和恰瑪古蜜膏3個劑量（40、20、10 g/kg）給藥組，各給藥組連續灌胃給藥 13 d，模型對照組給等量的蒸餾水（DW）。于給藥后第8天，每組小鼠用8%硫化鋇涂抹于腹部脫毛，范圍約3 cm×3 cm，每組小鼠均用 1%DNCB 丙酮麻油溶液（1∶1）50 μl均勻涂抹于褪毛區致敏，并于第2天再強化1次。致敏5 d后，將1%DNCB溶液10 μl均勻涂抹于各組小鼠右耳廓兩面進行攻擊。攻擊24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳片，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱重，以腫脹度來表示DTH的程度，計算腫脹抑制率。

腫脹度=右耳重-左耳重。

腫脹抑制率（%）=[（模型組腫脹度－給藥組腫脹度）/模型組腫脹度]×100%。

1.4.2 恰瑪古蜜膏對小鼠單核-巨噬細胞碳清除能力的影響[5-7]選取昆明種小鼠40只，體重18～22 g，按性別、體重隨機分為4組，分別為空白對照組和恰瑪古蜜膏三個劑量（40、20、10 g/kg）給藥組，各給藥組連續灌胃給藥10 d，對照組給等量的蒸餾水。末次給藥1 h后，各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁生理鹽水溶液（1∶4），按每10 g體重注射0.1 ml計算。各組小鼠分別于注射后 2 min（T1）和 10 min（T2）眼眶取血 20 μl，加入 2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻后于600 nm測吸光度值A1和A2，將動物處死后，取肝、脾稱重，計算碳廓清指數K值和吞噬指數α。

1.4.3 恰瑪古蜜膏對小鼠血清中IgM抗體水平的影響[8-9]選取昆明種小鼠40只，動物分組及給藥劑量同“1.4.2”，各給藥組連續灌胃給藥12 d，對照組給等量的蒸餾水。各組小鼠均在第4天給藥后2 h腹腔注射SRBC懸液0.2 ml/只。末次給藥1 h后，眼眶取血，離心分離血清，用生理鹽水稀釋200倍后按表1加樣。

表1 測定樣品吸光度值的加樣Tab.1 The spotting blank of determining the absorbance of sample

各管加樣后于37℃水浴保溫10 min，水浴終止反應后離心（2000 r/min，10 min）。取上清液1 ml加都氏試劑3 ml于試管內。同時取SRBC稀釋液0.25 ml、都氏試劑4 ml于另一支試管內，充分搖勻，放置10 min，于540 nm處以對照管作空白，分別測定各管吸光度值，計算半數溶血值HC50和抑制率。

HC50=（樣品吸光度值/SRBC半數溶血吸光度值）×血清稀釋倍數。

抑制率（%）=[（對照組 HC50－給藥組 HC50）/對照組 HC50]×100%。

1.4.4 恰瑪古蜜膏對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響[10-12]選取昆明種小鼠40只，動物分組及給藥劑量同“1.4.2”，各給藥組連續灌胃給藥10 d，對照組給等量的蒸餾水。于末次給藥1 h后，各組小鼠腹腔注射5%雞紅細胞0.4 ml，8 h后處死，剖腹露腹膜，向腹腔內注入生理鹽水2 ml，輕揉腹部1 min，吸取腹腔液0.2 ml涂于載玻片上，37℃孵育30 min，取出，以生理鹽水沖洗玻片，吹干，丙酮-甲醇（1∶1）固定 5 min，4%Giemsa染液染色 3～5 min，用蒸餾水漂洗，晾干后，在顯微鏡下觀察200個巨噬細胞，計算吞噬百分率和吞噬指數。

吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/200個巨噬細胞×100%。

吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數/200個巨噬細胞。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 恰瑪古蜜膏對二硝基氯苯誘導的小鼠遲發型超敏反應的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠耳腫脹度的作用，與對照組比較，恰瑪古蜜膏40 g/kg和20 g/kg劑量腫脹度顯著高于對照組（P＜0.01或P＜0.05），說明恰瑪古蜜膏能明顯增強DNCB引起的遲發型超敏反應，可激活T淋巴細胞和巨噬細胞。結果見表2。

表2 恰瑪古蜜膏對小鼠遲發型超敏反應的影響（，n=10）Tab.2 Effects of Brassica Campestris Ointment on delayed type hypersensitivity in mice(,n=10)

表2 恰瑪古蜜膏對小鼠遲發型超敏反應的影響（，n=10）Tab.2 Effects of Brassica Campestris Ointment on delayed type hypersensitivity in mice(,n=10)

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數 劑量 腫脹度 腫脹抑制率（g/kg） （%）對照組10-15.4±8.5-恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組101022.7±9.621.45恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組102019.3±7.9*33.22恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組104018.9±7.2**34.60

2.2 恰瑪古蜜膏對小鼠單核-巨噬細胞碳清除能力的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠單核-巨噬細胞碳清除能力的作用，與對照組比較，恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量可明顯提高小鼠碳廓清指數K和吞噬指數α（P＜0.01），20 g/kg劑量可提高小鼠巨噬細胞廓清指數K和吞噬指數α（P＜0.05），說明恰瑪古蜜膏能夠提高小鼠單核-巨噬細胞的碳清除能力。結果見表3。

表3 恰瑪古蜜膏對小鼠巨噬細胞碳清除能力的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Brassica Campestris Ointment on the function of phagocytosis in mice(,n=10)

表3 恰瑪古蜜膏對小鼠巨噬細胞碳清除能力的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Brassica Campestris Ointment on the function of phagocytosis in mice(,n=10)

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數 劑量 碳廓清 吞噬（g/kg） 指數K指數α對照組10-0.017±0.0065.040±0.367恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組10100.019±0.0075.121±0.910恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組10200.022±0.009*5.280±0.752*恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組10400.027±0.004**5.641±0.843**

2.3 恰瑪古蜜膏對小鼠血清中IgM抗體水平的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠血清中IgM抗體水平的作用，恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量與對照組比較，差異有統計學意義；半數溶血值HC50顯著高于對照組（P＜0.05），說明恰瑪古蜜膏可促進小鼠血清中IgM抗體的生成。結果見表4。

表4 恰瑪古蜜膏對小鼠血清溶血素含量的影響（，n=10）Tab.4 Effects of Brassica Campestris Ointment on productions of hemolysin in mice(，n=10)

表4 恰瑪古蜜膏對小鼠血清溶血素含量的影響（，n=10）Tab.4 Effects of Brassica Campestris Ointment on productions of hemolysin in mice(，n=10)

與對照組比較，*P<0.05

組別 只數 劑量 半數溶 抑制率（%）（g/kg） 血值HC50對照組10-18.6±4.3-恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組101021.7±5.8-16.97恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組102023.6±15.8-26.97恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組104029.9±14.3*-60.50

2.4 恰瑪古蜜膏對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

不同劑量的恰瑪古蜜膏都有提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的作用，恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數明顯高于對照組（P＜0.05）。結果見表5。

表5 恰瑪古蜜膏對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Brassica Campestris Ointment on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages(,n=10)

表5 恰瑪古蜜膏對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Brassica Campestris Ointment on phagocytosis of mouse peritoneal macrophages(,n=10)

與對照組比較，*P<0.05

組別 只數 劑量 吞噬 吞噬指數（g/kg） 百分率（%） 對照組10-16.2±1.70.252±0.046恰瑪古蜜膏10 g/kg劑量組101016.9±2.70.275±0.032恰瑪古蜜膏20 g/kg劑量組102018.7±4.10.313±0.079恰瑪古蜜膏40 g/kg劑量組104018.9±3.4*0.299±0.042*

3 討論

實驗結果顯示，恰瑪古蜜膏能提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，明顯增強DNCB引起的遲發型超敏反應，提高小鼠單核-巨噬細胞清除血液中碳粒的能力，提高小鼠血清中IgM抗體水平。因此，根據實驗結果可判定恰瑪古蜜膏具有良好的增強免疫功能的作用，是一種良好的免疫促進劑。目前對恰瑪古在其藥理方面作用的研究甚少，本研究初步顯示了恰瑪古在提高機體免疫功能方面的藥理作用，為其進一步開發恰瑪古的藥用價值提供必要的依據。

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