TIMP-1對人牙周膜成纖維細胞增殖與ALP活性表達的影響

高曉林，李 瑛

（山西醫科大學第二附屬醫院口腔科，山西太原 030001）

金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）是天然的基質金屬蛋白酶（MMPs）抑制劑，存在于大多數組織和體液中。通過調節MMPs活性維持細胞外基質（ECM）的內環境穩定及組織重建[1]。目前，TIMPs已發現有 4 種類型：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4[2]。 其中，TIMP-1一直是分子細胞生物學研究的重點，隨著研究的不斷深入，發現TIMP-1是一種多功能蛋白，除了可以調節ECM代謝之外，TIMP-1還能調控細胞增殖分化、凋亡、遷徙、血管生成等，這些功能并非完全通過抑制MMP的途徑[3]。但TIMP-1對牙周膜成纖維細胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLF）的生物學特性的影響報道較少。本實驗的目的是觀察外源性TIMP-1對體外培養的PDLF的生長增殖和ALP活性表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

人重組金屬蛋白酶組織抑制劑-1（recombinant human TIMP-1，Peprotech，USA）；DMEM（culbecco's modified eagle media）培養液（Gibco，USA）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；25 ml塑料培養瓶、96 孔板（Orangescientific）；CO2培養箱（AshevilleNC，USA）；Unic7200分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）。

1.2 人PDLF細胞體外培養

將儲存在液氮中的第3代PDLF取出后迅速置于37℃水浴箱中加熱，完全溶解后移入25 ml培養瓶中，加入5 ml含100 ml/L滅活FBS、100 mg/L鏈霉素、100 U/L青霉素的DMEM培養液，混勻后置37℃、50 ml/L CO2、950 ml/L空氣的標準環境下孵育，每3天換液1次，直至細胞長滿瓶底80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化法進行傳代，取5～7代細胞用于實驗。

1.3 方法

1.3.1 接種細胞及分組 取第5代PDLF，用胰酶消化后制成細胞懸液，以2×105/ml的濃度接種于 96孔板內，每孔 100 μl，置入37℃、5%CO2的無菌孵箱中培養24 h后，棄孔內培養液，PBS液洗2次，分為1個對照組和4個實驗組，每組8孔。對照組加入10%FBS的DMEM培養液，實驗組分別加入含系列濃度 TIMP-1（1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）的DMEM培養液，每孔 100 μl。 培養 24、48和 72 h，分別測定 MTT和ALP活性。

1.3.2 噻唑藍（MTT）檢測 培養不同時間后，每孔加入MTT液（5 mg/ml）20 μl，37℃培養 4 h，棄培養液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl，混勻，酶標儀測 OD 值，波長 490 nm。

1.3.3 堿性磷酸酶（ALP）檢測 培養不同時間后，每孔取50 μl加入到測定管，再分別加入0.5 ml的緩沖液和基質液；標準管中為50 μl的0.1 mg/ml酚標準應用液和分別加入的0.5 ml的緩沖液和基質液；空白管中為50 μl的雙蒸水和分別加入的0.5 ml的緩沖液和基質液，將其充分混勻，37℃水浴15 min。每管加入1.5 ml顯色劑，立即混勻，分光光度計比色，空白管調零，測各管吸光度，波長為520 nm。堿性磷酸酶（金氏單位/100 ml）=（測定管吸光度/標準管吸光度）×標準管含酚的量（0.005 mg）×（100 ml/0.005 ml）。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，對各組8個標本測定數值的均值進行單因素方差分析，并比較各實驗組與對照組之間的差異，顯著性水準α=0.05。

2 結果

2.1 MTT檢測結果

與對照組比較，1 ng/ml的 TIMP-1在 24、48、72 h時對PDLC有顯著的促增殖作用（P＜0.05），10 ng/ml的 TIMP-1 在48、72 h對PDLC有顯著的促增殖作用（P＜0.05），而100 ng/ml的TIMP-1則對PDLC有抑制作用。

2.2 ALP檢測結果

與對照組相比，1 ng/ml的TIMP-1在24、48和72 h對PDLC有顯著增強ALP活性的作用（P＜0.05），10 ng/ml的TIMP-1在48 h對PDLC有顯著增強ALP活性的作用（P＜0.05），而50 ng/ml的 TIMP-1在 72 h時及 100 ng/ml TIMP-1在24、48和 72 h時對PDLC有抑制作用。

表1 TIMP-1對人牙周膜細胞的增殖和ALP活性的影響（，ng/ml）

表1 TIMP-1對人牙周膜細胞的增殖和ALP活性的影響（，ng/ml）

與對照組比較，*P＜0.05

檢測 時間TIMP-1實驗組方法 （h） 對照組 110 50100 MTT240.282±0.0110.307±0.015*0.299±0.0180.280±0.0090.250±0.013*480.301±0.0220.344±0.023*0.348±0.027*0.326±0.0190.263±0.012*720.327±0.0320.390±0.035*0.387±0.015*0.366±0.0410.281±0.031*ALP242.857±0.2103.273±0.278*3.015±0.2272.554±0.2892.265±0.392*484.439±0.2565.043±0.298*4.949±0.310*4.275±0.3743.231±0.313*724.623±0.3745.271±0.373*4.850±0.4484.089±0.310*3.344±0.428*

3 討論

牙周病是引起牙周組織缺損最終導致牙齒缺失的常見病因。PDLF是牙周組織內的主要細胞成分，在牙周組織再生與修復中發揮重要作用。其中多種生物活性因子構成的因子網絡可影響其修復和再生，因此，充分開發和運用生物活性因子，促進牙周再生能力和潛力成為當前研究領域的重點之一。PDLF與其他成纖維細胞不同，除具有形成及維持牙周膜的特殊功能外，還對鄰近的牙槽骨和牙骨質具有修復、改建和再生的作用。

TIMP-1是一個包括184個氨基酸長度的單鏈多肽，它包含由12個半胱氨酸殘基形成的6個二硫鍵，將TIMP-1分子分隔為2個單獨的區域[4-5]。它是一個伴有糖基化和非糖基化形式的高糖基化分子，具有的表觀分子量分別為20.0和28.5 kDa。人類的TIMP-1基因位于X染色體，Xp11.1[5]。TIMP-1可由成纖維細胞、上皮和內皮細胞等多種細胞表達，并可誘導包括角質化細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、上皮和內皮細胞等多種正常細胞的生長[1]。據報道，TIMP-1蛋白可在人牙齦成纖維細胞（Gin-1 cells）的胞核中積聚，在細胞周期的S期達到最大量[6]。

堿性磷酸酶是機體內的一種重要的酶類，廣泛分布于體內幾乎所有的器官。通過水解磷酸酯破壞礦化抑制物及通過作為鈣結合蛋白和磷酸基轉運因子而促進礦化，其活性可反映相應細胞向成骨方向轉化的趨勢。因此，ALP活性已成為觀察牙周膜成纖維細胞分化功能的一項重要指標[7]。

本實驗結果表明，TIMP-1可以促進PDLF的增殖和分化，進而促進PDLF對牙根附著和向成骨細胞分化，使之有利于牙周組織修復和牙槽骨重建，這一研究也為牙周病的治療提供了重要的理論依據。

TIMP-1可通過酪氨酸磷酸化及之后的有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）的活化，促進人骨肉瘤細胞株的增殖[8]。Akahame等[9]研究表明，TIMP-1通過細胞外信號調節激酶（ERK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號途徑，促進主動脈平滑肌細胞（AoSMC）細胞周期進行。TIMP-1促進成纖維細胞增殖的信號轉導通路有待進一步研究。

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