普通煙草WDR基因的克隆與序列分析

雷 波，陳 偉，王茂勝，潘文杰，李繼新

（貴州省煙草科學研究所，貴陽550081）

煙草（Nicotiana tobacumL.）莖、葉表面密布腺毛，一般占總表皮毛的85%[1]，煙草腺毛的形態結構與其分泌功能有著密切關系。有研究表明，煙葉表面的腺毛及其分泌物與煙葉香氣質和香氣量有密切關系，通常腺毛密度高、發育狀況好、腺毛分泌物多的煙葉，其香氣就濃郁、醇厚和飽滿[2-3]。

煙草腺毛是一種多細胞表皮毛，它的形態建成受到一系列轉錄因子的調控。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，表皮毛的發育機制已得到初步闡明。雖然煙草等植物的表皮毛發育機制與擬南芥不同，但都受到WD40-bHLH-MYB的調控，不同之處是 bHLH和 MYB轉錄因子不同。因此WD40蛋白是煙草腺毛發育中重要的調控因子之一。WD40蛋白含有約40個氨基酸的保守序列，在大部分生物中含有多個串聯WD保守序列，因此也稱WD-Repeat蛋白（WDR），主要參與信號傳導、細胞周期調控、轉錄抑制等[4]。目前關于煙草腺毛的研究大部分集中在腺毛密度、形態、化學成分等對煙葉品質的影響方面[5]，分子水平上的研究較少。本研究利用RT-PCR從云煙85中克隆出WDR基因的全長cDNA序列，進行生物信息學分析，為研究WDR基因在煙草中的表達模式、分子進化以及腺毛的形態建成分子機制等打下基礎，也有助于不同質量風格特色煙葉形成的發育和分子基礎的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 普通煙草栽培品種云煙85。

1.1.2 載體和菌株 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本實驗室保存。T-載體pMD19-T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要試劑與試劑盒 RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒和小量植物組織 RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司；DL2000 DNA marker、TaqDNA聚合酶和其它分子生物學試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。引物合成和DNA測序由上海英駿生物技術公司商業完成。

1.2 方法

1.2.1 煙草葉總RNA的提取 以云煙85幼葉為材料，按照上海華舜生物技術有限公司的小量植物組織RNA抽提試劑盒提供的方法提取總RNA。

1.2.2 煙草葉總 cDNA第一鏈的獲得 以云煙 85幼葉總 RNA樣品 1 μg為模版，采用 Oligo dT-Adaptor Primer進行反轉錄，反轉錄后產物即為總cDNA第一鏈。反轉錄按照TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒說明書略加修改進行。反轉錄條件為：42℃ 40 min，50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃5min。

1.2.3 煙草WDR（NtWDR）基因的克隆 將矮牽牛（Petunia x hybrida）WD repeat proteinAN11基因（PhAN11）（U94748）cDNA 序列提交到 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網站的 expressed sequence tags(EST)和genomic survey sequence(GSS)序列庫進行核酸序列比對，得到與PhAN11高度相似的煙草 EST和 GSS序列，采用 Vector NTI Advance 9.0軟件進行所獲得的EST和GSS序列的多重比對和Contig的拼接。根據多重比對結果，設計 5′和 3′-末端特異引物 FWDR（5′- GAG GGG AGT CAT ATC ATC ACA ATT TTC T-3′）和 RWDR（5′-CAG TAA CTC ACT AAT ACA TTA TCT AAC AC-3′）用于擴增NtWDR全長cDNA序列。

以煙草幼葉cDNA第一鏈3 μL為模版，采用標準的50 μLTaqPCR反應體系，擴增NtWDR全長cDNA序列。PCR擴增的參數如下：94 °C預變性2 min，35 個擴增循環（94 °C 變性 1 min，58 °C 退火 1 min，72 °C 延伸 2 min），72 °C 保溫 10 min。將獲得的PCR產物膠回收后，經過T-A克隆，單克隆子PCR檢測后，陽性克隆子送樣測序。

1.2.4NtWDRcDNA序列的生物信息學分析 序列比對、open reading frame（ORF）查找和翻譯、蛋白質基本性質等在Vector NTI Advance 9.0軟件上進行。BLAST分析以及蛋白序列的保守結構域搜索在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網站上進行，蛋白質結構預測在 Expasy（http://www.expasy.org）網站提供的在線分析軟件上進行。

2 結 果

2.1 NtWDR cDNA序列的克隆和核苷酸序列基本參數

通過BLASTn分析后共獲得煙草WDR基因的12條EST序列，9條GSS序列。采用Vector NTI Advance 9.0軟件進行EST和GSS序列多重比對和拼接。BLASTn分析表明該序列與大部分物種WDR基因具有廣泛的同源性。可以初步認定其為煙草WDR基因。

以FWDR和RWDR擴增引物，RT-PCR擴增后獲得1條約1.4 kb的特異條帶，膠回收、T-A克隆和測序。測序結果表明，煙草WDR基因cDNA全長為1 433 bp，命名為NtWDR，Gene Bank登錄號為GQ260131。NtWDRcDNA的148-1 176 bp處有1個1 029 bp的開放性閱讀框（ORF）（含終止密碼子），編碼342個氨基酸的蛋白質（圖1），Gene Bank登錄號為ACT35693。5′非翻譯區（UTR）和3′UTR長度分別為147 bp和257 bp，其GC含量分別為40.82% 和37.35%。

2.2 NtWDR蛋白基本參數和可能的翻譯后修飾

NtWDR蛋白長度為342氨基酸（aa），分子量（Mw）為38.49 kDa，等電點（pI）為4.81，其中極性氨基酸比例 28.07%，酸性氨基酸比例為13.45%，堿性氨基酸比例為8.48%。含量最豐富的為絲氨酸 Ser，占總氨基酸的 9.18%，其次是 Leu和Ile，為8.23%。NCBI保守域搜索表明，NtWDR蛋白含有 2個交迭保守域 WD40（H78～E294）和COG2319（D77～T297），含有 2 個 WD40 repeats（WDRs），分別位于 K165～D203和 P257～K336，說明所克隆的NtWDR基因是WDR超基因家族成員。

圖1 NtWDR cDNA序列和推測的蛋白質序列起始密碼子ATG和終止密碼子用粗體加下劃線表示，氨基酸序列中WD保守域用下劃線表示Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequences of NtWDRIn the nucleotide sequence,the start codon ATG and the stop codon are in underlined bold face,the WD domains are underlined

采用 SignalP 3.0[6]、TargetP 1.1[7]和 SOSUI預測NtWDR蛋白無信號肽和信號肽錨定的概率為0或概率極小，因此NtWDR蛋白沒有信號肽。NetNGlyc 1.0[8]和PROSITE預測NtWDR蛋白有4個潛在的N-糖基化位點，但糖基化一般發生在信號受體蛋白分子上，而NtWDR蛋白無信號肽，說明在體內這些預測的潛在位點可能不能真正被糖基化。NetPhos 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[9]預測NtWDR蛋白存在26個磷酸化位點，其潛在Ser、Thr和Tyr活性位點數分別為18、3和5個,NtWDR蛋白存在著豐富的磷酸化位點，說明磷酸化位點修飾對WDR蛋白的功能可能非常重要，也可能是這些磷酸化參與WDR蛋白活性的調控。采用TargetP 1.1預測，NtWDR蛋白亞細胞定位不是葉綠體蛋白或線粒體蛋白，很可能是定位于其他位置，概率達到了 0.841。Softberry-ProtComp 8.0（http://www.softberry.com/）預測結果認為NtWDR蛋白定位于細胞質，預測得分為9.9。WoLFPSORT預測表明，NtWDR蛋白沒有核定位信號。采用TMpred[10]、TMHMM[11]和ConPred II軟件預測NtWDR蛋白均無跨膜螺旋。

SOPMA預測表明，NtWDR蛋白的二級結構隨機卷曲（random coil）所占比例最高，為51.46%，其次是延伸鏈（extended strand），占34.21%，α螺旋（alpha helix）和β轉角（beta turn）所占比例最少，不足10%。SWISS-MODEL和ESyPred3D都未能預測出NtWDR蛋白的三級結構。

2.3 NtWDR基因同源性分析

BLASTn分析表明，NtWDR基因與大部分物種的WD40基因具有廣泛的同源性，其中與NtTTG1like protein mRNA（FJ795022.1）同源性最高，在核苷酸水平上一致性達到 94%，其次是番茄（Lycopersicon esculentum）表皮毛克隆到的基因113964R（BT012869），一致性達到86%，與PhAN11基因cDNA一致性為84%，而與AtTTG1基因cDNA一致性為74%。

BLASTp分析表明，NtWDR蛋白與WD40蛋白具有很高的同源性，特別是與AN11/TTG1蛋白具有很高的同源性，其中與 NtTTG1 like Protein（ACN87316.1）具有最高的同源性，一致性達到98%，相似性為 99%。其次是 PhAN11（AAC18914.1），在蛋白質水平上，一致性和相似性分別為92%和95%，而與NtTTG1（ACJ06978）一致性/相似性只有77%/88%。從系統發生（圖2）來看，NtWDR首先與NtTTG1 like Protein聚在一起后，與PhAN11聚成一個小類，再與紫蘇、葡萄等植物WDR聚在一起，與AtTTG1親緣關系較遠。蛋白質水平多重比對（圖3）表明，NtWDR雖然與AtTTG1等親緣關系較遠，但C端及其保守，說明C端與WDR功能密切相關。綜合BLASTs、系統進化和蛋白質序列多重比對分析結果，說明NtWDR基因是矮牽牛WDR基因PhAN11和番茄113964R的垂直同源基因。

3 討 論

TTG1/AN11類型的WD40蛋白在參與所有高等真核生物表皮形成過程中具有廣泛的功能[12]，它們與MYB蛋白和bHLH蛋白形成的轉錄因子復合體是植物界中一個普遍存在的調控途徑，參與調控多種細胞的分化和發育途徑等[13-14]。TTG1/AN11類型的WD40蛋白在MYB-bHLH-WD40轉錄因子復合體中為其它轉錄因子的聚集和互作提供一個基礎平臺[2]。在擬南芥、矮牽牛、棉花、玉米、紫羅蘭等多個植物的研究中表明，TTG1/AN11類型的WD40蛋白在表皮毛的形成、種子表皮及色素的發育起著非常重要的作用[15-17]。

在新基因功能預測中，主要是利用同源基因的功能來推測。同源基因分為垂直同源基因和水平同源基因。垂直同源基因來自不同的物種，起源于同一祖先，其功能在各個物種中相似，水平同源基因是同一基因在相同物種中由于復制而產生的[18-19]。在本研究中，利用RT-PCR方法從普通煙草中克隆得到NtWDR基因的全長cDNA序列，BLASTs分析表明，它與WD40超基因家族有著廣泛的同源性。NtWDR基因與Le113964R和PhAN11，在mRNA水平上，一致性分別為86%和84%；蛋白質水平上，一致性/相似性達到了93%/97%和 92%/95%。在蛋白結構上，NtWDR有2個WD40保守區域，在亞細胞定位、信號肽、磷酸化位點、二級結構等方面的預測結果也符合AN11/TTG1類型的WD40蛋白的特征。同源分析和蛋白結構分析進一步證明，NtWDR基因是Le113964R和PhAN11基因的垂直同源基因，推測它們有著相似的功能，即調控表皮毛的發育、花色、種皮色素的合成等功能[20]。普通煙草是異源四倍體植物，通過EST和GSS序列標簽以及BLASTs比對發現，NtWDR基因家族成員數可能有2個以上，所克隆的NtWDR基因與NtTTG1like基因高度同源，在cDNA水平上一致性達到94%，在蛋白水平上一致性和相似性達到98%和99%，聚類分析也表明兩者同源性最高。因此，NtWDR基因和NtTTG1like基因是水平同源基因。在植物界中，表皮毛的發育受WD40-bHLH-MYB機制調控，在模式植物擬南芥中，目前已鑒定有超過 20個轉錄因子參與表皮毛的發育調控[21]。金魚草MIXTA基因（MYB轉錄因子）和CotMYB基因在煙草中表達能增加煙草表皮毛的數量[22]。煙草腺毛作為一種多細胞的表皮毛，其發育也受到一系列轉錄因子的調控，其中也包括WDR基因的調控。在煙草腺毛的發育過程中，NtWDR基因的表達是否存在時空和組織特異性，是否受到生態環境的影響，它將如何與MYB和bHLH轉錄因子互作，進而影響煙草腺毛形態建成的問題還需要進一步研究。

圖2 NtWDR和來自其它植物WDR蛋白的系統進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of NtWDR and other plant WDRs

圖3 NtWDR蛋白與其它WDR蛋白多重比對Fig.3 Multi-alignment of NtWDR and other WDR proteins

4 結 論

煙草腺毛的形態結構與其分泌功能有著密切的關系，目前關于煙草腺毛發育的調控基因報道較少。本研究通過 RT-PCR法，從普通煙草云煙 85中克隆到一條腺毛發育的重要調控基因，NtWDR基因的全長 cDNA序列，GeneBank登錄號為GQ260131。該基因的克隆為研究煙草腺毛形態建成和不同質量風格特色煙葉形成的發育和分子基礎提供了一定的參考價值。

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