茉莉酸甲酯對煙草α-淀粉酶抑制劑的誘導作用

徐佩佩，程新勝

（1.中國科學技術大學煙草與健康研究中心，合肥 230052；2.安徽大學生命科學學院，合肥 230039）

α-淀粉酶抑制劑（а-amylase inhibitor,αAI）是一種熱穩定性的糖蛋白[1]，近年來，不少研究表明它對植物抵御昆蟲傷害有重要作用[2]。一般認為其抗蟲作用機制是與昆蟲體內的淀粉酶以1:1的分子比例結合形成穩定的酶-抑制劑復合物(EI)，從而抑制淀粉酶活性，使昆蟲攝取的食物中淀粉類物質無法水解、消化，導致昆蟲能量來源減少；同時，EI復合物還刺激昆蟲的消化腺過量分泌消化酶，通過神經系統的反饋，使昆蟲產生厭食反應，影響其正常取食，令其生長發育緩慢，甚至導致死亡[1-3]。

茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)是一種植物生長調節物質。自Farmer和Ryan報道外源MeJA能夠誘導植物產生抗蟲性后，MeJA的這種生物學功能受到廣泛關注[4]，現已證實，MeJA誘導植物產生的抗性作用是通過茉莉酸(JA)信號分子的傳導，激發植物形成防御反應，過氧化物酶(Peroxidase,POD)、多酚氧化酶 (Polyphenoloxidase,PPO)活性增加，形成特異性胰蛋白酶抑制劑(Trypsin proteinase inhabitor,TrypPI) 和胰凝乳蛋白酶抑制劑(Chrymoltrypsin proteinase inhibitor ChymPI),一些內源抗生性物質含量增加（如煙堿），從而提高植物自身的抗蟲性[5]。Carla Sanchez-Hernandez報道外源的MeJA和脫落酸(Abscisic acid)處理千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)，可誘導其葉片中TrypPI和αAI含量增加，但高溫、干旱或鹽害等非生物脅迫(Abiotic Stress)則沒有這種誘導效應[6]；進一步的試驗證明，MeJA誘抗處理后，αAI的表達與 29 kDa TrypPI的表達情況很相似；在番茄(Lycopersicon esculentum)和馬鈴薯(Solanum tuberosum)中也存在類似的情況，表明 MeJA誘導產生的酶抑制劑可能有著相似的表達調控機制。席征等對 MeJA處理后煙草中 POD,PPO,TrypPI,ChymPI以及對斜紋夜蛾(Spodoptera lituraF.)生長的影響進行了較為系統的研究，但未見MeJA誘導煙草αAI的表達特性和生物學效應方面的報道[7]。本實驗以煙草普通商業品種為供試材料，研究了MeJA誘導處理煙草葉片中αAI表達的時間及濃度效應，同時就MeJA處理后的煙草葉片對斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙草 普通煙草栽培品種 K326（Nicotiana tabacumL.CV.K326），煙草種子在實驗室內培育發芽，待生長至四葉期，移栽至裝有蛭石的塑料盆缽中，在（25±3）℃的培養室中，每天 900 μmo1/(m2·s)光照12 h，并定期澆灌Hoagland及Snyder營養液，待煙苗第6片葉平展后用于MeJA誘抗處理[8]。

1.1.2 斜紋夜蛾 人工飼料飼養，飼養條件：溫度28 ℃，光照12 h，相對濕度70%，選擇生長整齊一致的5齡幼蟲用于試驗。

1.1.3 試劑來源及配制 MeJA，英國 Apex Organics公司；考馬斯亮藍 G-250和淀粉，Fluka公司(Buchs,Switzerland)；α-淀粉酶，美國 Sigma公司；DNS試劑參照文獻[9]配制；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚等化學試劑均為國產分析純；麥芽糖，天津大茂化學試劑廠，分析純；試驗用水為雙蒸水。

1.1.4 儀器 TGL-20G高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；756P紫外－可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DIALAB ELx 800全自動酶標儀，奧地利Labexin公司。

1.2 試驗處理

MeJA溶液的配置：用無水乙醇溶解MeJA，再用雙蒸水稀釋至所需濃度，控制乙醇的終濃度為0.9%。對照組（CK）為 0.9%的乙醇水稀釋液。用小型噴霧器在煙株上均勻地噴灑MeJA溶液，每株噴液量為20 mL，對照株則噴施等量0.9%的乙醇溶液。由于MeJA具有揮發性，所以將各處理組煙株放置于培養室不同隔間以避免處理間相互干擾。

1.2.1 MeJA的誘抗處理 將 MeJA分別配制成0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmo1/L 五種梯度濃度。隨機選取6組煙苗，每組6株，分別用對照液或5種不同濃度的MeJA進行處理，在噴液后24，48，72 h剪下被處理煙株倒數第 3片葉（從上向下數），迅速用塑料樣品袋密封，置于 4 ℃的冰箱中保存，1周內進行生化分析。

1.2.2 斜紋夜蛾的處理 試驗時首先讓試蟲在塑料養蟲缽(5 cm×10 cm×5 cm)中用未處理煙葉適應性飼養24 h后饑餓12 h，轉入放置有不同處理煙葉的養蟲缽內，讓其取食24 h，用于測定中腸α-淀粉酶活性。

1.3 前處理和生化分析

1.3.1 煙草 αAI的提取與活性檢測 煙葉 αAI 提取參照Willdon DC等的方法，并略作改進：采集不同處理的煙葉并除去主脈，稱重，按m/v=1:10加入 pH 7.8的 Tris-HCI緩沖液（內含 0.1%的Tween20），冰浴中勻漿，勻漿液轉入離心管中，在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min，上清液為待測液[10]。

αAI活性檢測采用Van Loon碘比色法：取磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）配置濃度為1 mg/mL的α-淀粉酶0.25 mL，加入待測液0.25 mL，37 ℃下反應30 min，加入1%可溶性淀粉溶液1 mL，37 ℃恒溫反應 15 min 后加碘顯色，對照中不加淀粉酶抑制劑待測液,代以等量的磷酸鹽緩沖液。在酶標儀上于660 nm處測定吸光度值。根據吸光度的差異計算抑制劑的相對活性[11]。

αAI的抑制活性表示方法為αAI活性 = AE660-AI660

上式中：AE660為對照管在 660 nm的吸光值;AI660為加入淀粉酶抑制劑待測液后的樣品在 660 nm的吸光值。

1.3.2 斜紋夜蛾中腸 α-淀粉酶活性檢測 斜紋夜蛾的解剖及中腸 α-淀粉酶活性的測定分別參照文獻[9]和[12]。10頭5齡幼蟲為1組，用天平分別測定其體質量后，在冰盤上迅速解剖，用預冷的PBS緩沖液（pH 6.0）沖去體液，取中腸，加5 mL預冷緩沖液在冰浴中勻漿，勻漿液在4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清液作為酶液。取2%淀粉0.2 mL、0.2 mol/L PBS （pH6.0）0.8 mL、酶液 80 μL，室溫下反應10 min后，置于37 ℃水浴中60 min加1 mL DNS試劑終止反應，然后在沸水浴中處理 5 min，于550 nm處測吸光值。用0.2 mol/L PBS（pH 6.0）80 μL代替酶液作為對照。

α-淀粉酶活性/(mg·g-1·min-1)=C×Vt/(W×Vs×t)

其中，C為麥芽糖含量（mg）；Vt為反應所用淀粉酶原液體積（mL）；Vs為淀粉酶原液總體積（mL）；W為蟲體質量（g）；t為反應時間（min）。麥芽糖標準曲線在0～2 mg區間內獲得。

α-淀粉酶活性抑制率/%=(對照組α-淀粉酶活性-處理組 α-淀粉酶活性）×100/對照組 α-淀粉酶活性；

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS12.0統計軟件進行Duncan分析，比較各處理間的差異顯著性。

2 結 果

2.1 MeJA誘導煙草產生α-AI的濃度與時間效應

從圖1可以看出，除了圖1（b）中0.01 mmol/L外，其它各項處理皆與CK間存在顯著的差異，在3個不同的時間段，隨著 MeJA濃度的增加，αAI活性漸上升并在 4 mmol/L處理達到最高，10 mmol/L處理則有所下降。處理24 h后圖1（a），0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmol/L MeJA處理組αAI的活性分別是對照組的1.31倍、1.37倍、1.32倍、1.75倍和1.63倍，0.01,0.1,1.0,10.0 mmol/L 四個處理間差異不顯著，但0.01,0.1,1.0 mmol/L三處理與CK及4.0 mmol/L處理間的差異性顯著；處理48 h后圖1（b），0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmol/L MeJA 處理組αAI的活性分別是對照組的1.63倍、1.75倍、1.87倍、2.44倍和1.87倍，4.0 mmol/L與其它組處理間差異顯著；處理72 h后圖1（c），0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmol/L MeJA處理組αAI的活性分別是對照組的1.38,1.49,1.75,1.81,1.76倍，0.01和0.1mmol/L處理組與4.0 mmol/L處理組間差異顯著。

圖1 不同處理各濃度MeJA誘導的煙草αAI活性Fig.1 Different concentrations of MeJA induced а-amylase inhibitor activity in tobacco leaves

圖2顯示了CK和5種濃度的MeJA處理在3個不同的時間段內對煙葉αAI的誘導情況。就總體變化趨勢而言，各個濃度MeJA處理變化趨勢較一致：除對照外，5個濃度處理在24 h的活性較低，在48 h時達到最大值，隨著時間延長到72 h后則有所下降。

2.2 斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性比較

分別將對照和0.1，1.0，10.0 mmol/L 三種濃度MeJA 處理24，48，72 h 后的煙葉放入對應的養蟲缽內，讓斜紋夜蛾 5齡幼蟲取食，后檢測各試蟲體內中腸α-淀粉酶活力，結果見表1。MeJA處理24 h的，取食不同濃度MeJA處理煙葉的斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性均小于對照，隨著MeJA的濃度從0.1 mmol/L增加到10.0 mmol/L，斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性逐漸降低，α-淀粉酶的抑制率隨MeJA濃度升高而增加；統計分析表明，所有MeJA處理與CK呈顯著性差異，處理組內，1.0 mmol/L和10.0 mmol/L處理與0.1 mmol/L處理間差異顯著；處理48 h的，取食MeJA處理煙葉的斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性均小于對照，抑制率隨MeJA的濃度升高而上升，處理間差異顯著性與24 h的類似；取食MeJA處理72 h煙葉的斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性也是處理組小于 CK，且差異顯著，處理組內，10.0 mmol/L處理組中腸 α-淀粉酶活性小于 0.1 mmol/L和1.0 mmol/L處理，且差異顯著。

圖2 MeJA處理時間對煙草αAI的影響Fig.2 Different time treatment induced tobaccoа-AI activity

表1 取食不同濃度MeJA處理煙草斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶活性比較Table 1 Spodoptera litura (F.) midgut а-amylase activity after fed on different concentrations of MeJA treatment tobacco leaves

表1 取食不同濃度MeJA處理煙草斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶活性比較Table 1 Spodoptera litura (F.) midgut а-amylase activity after fed on different concentrations of MeJA treatment tobacco leaves

注：數值后不同小寫字母表示5%顯著差異。

處理時間/h CK酶活性 酶活性/(mg·g-1·min-1) 抑制率/% 酶活性/(mg·g-1·min-1) 抑制率/% 酶活性/(mg·g-1·min-1) 抑制率/%0.1 mmol/L 1.0 mmol/L 10.0 mmol/L 24 0.487±0.017 0.387±0.027 20.5 0.317±0.022 c 35.9 0.311±0.033 36.1 48 0.495±0.023 0.394±0.042 20.4 0.308±0.055 c 37.8 0.298±0.029 39.8 72 0.476±0.035 0.377±0.018 20.8 0.322±0.041 b 32.4 0.268±0.018 43.7

3 討 論

由昆蟲取食所引發的植物防御反應并非是單一途徑，它可能引起植物整個的代謝重組[13]。MeJA作為一種外源信號物質處理植物后可以提高植物POD、PPO以及TrypPI和ChymPI的活性，增加內源抗生性物質含量（如丁布[14]、異硫氰酸鹽[15]、煙堿[16]）。本實驗室前期研究表明，在 MeJA處理煙草普通栽培品種K326的植株后，其POD，PPO，TrypPI，ChymPI亦增加；在取食MeJA處理的煙草葉片后，斜紋夜蛾幼蟲相對生長速率(RGR)降低[7]。本實驗結果顯示，MeJA處理可誘導煙草葉片 αAI活性增加，斜紋夜蛾取食后，中腸α-淀粉酶活性逐漸降低。MeJA的處理不僅可以使斜紋夜蛾幼蟲對煙葉蛋白質的吸收利用受到了抑制，而且對淀粉的分解吸收也受到抑制，可能正是這些多重作用導致了斜紋夜蛾幼蟲RGR的降低。

Benjamin A Babst等[17]利用C11標記研究JA處理美洲山楊(Populus tremuloides)后發現，JA處理可導致處理葉及系統葉片上淀粉類物質向植株的根部和主莖移動，葉片中淀粉含量降低，同時光合作用速率沒有改變。Jens Schwachtje指出，對野生煙草植株進行模擬害蟲取食處理后，蔗糖非發酵蛋白激酶(SNF1)介導煙草植株將更多的碳水化合物貯存到根部組織中，使葉片組織中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量降低[18]，同時也為自身下一步的生長貯存能量。對于已經合成、沉積在葉片中的淀粉類物質，植物通過增加葉片中αAI含量，來抑制害蟲對淀粉類物質的消化能力，減少其利用吸收，從而構建更加全面的防御體系。

外源MeJA的濃度與其對煙草植株αAI的誘導作用僅在一定濃度范圍內成正相關（圖1），這與前期MeJA處理對煙草TrypPI、ChymP誘導試驗情況相似[7]，說明MeJA對煙草的誘抗效應與其施用劑量并不總是呈正相關，煙草只有在施用合適劑量的MeJA后才能產生最強的信號應答，低劑量下或劑量過高，煙草產生的局部或系統性應答強度都會減弱。Carolyn等也曾報道長春花（Catharanthusroseus）細胞培養株分別用 10，50，100，500 μmol/L MeJA處理后，阿嗎堿（ajmalicine）在100 μmol/L處理中積累最多[19]，這可能與植物抗性的JA和SA路徑的應答有關[20]，當MeJA用量較低時，內源JA的增加及相應的抗性應答隨著MeJA劑量增加而上升;然而，植物的這種應答是有一定限度的，當MeJA用量超過植物的應答限度，多余的MeJA反倒會誘導SA信號路徑的功能性成份（如MeSA）增加，從而抑制JA信號路徑的應答[21]。MeJA誘抗的這種劑量效應特征提醒我們，在田間利用MeJA作誘抗處理時，一定要選擇合適的劑量才能取得最佳的誘抗效果。

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