細胞因子誘導的蛋白質巰基亞硝基化對大鼠成纖維細胞樣滑膜細胞中CREB蛋白的 DNA結合活性的影響*

張曉靜，叢 斌△，張鳳華，李淑瑾，馬春玲，付麗紅，倪志宇，于 峰

(1河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017;2河北醫科大學中西醫結合學院，河北 石家莊 050091)

一氧化氮(nitric oxide，NO)可對蛋白質半胱氨酸巰基(－SH)進行多種形式的氧化修飾，改變蛋白質構象，調節蛋白質功能，這是NO發揮多種生物學作用的機制之一。研究證實，高濃度NO主要引起巰基發生不可逆性氧化修飾，是NO介導炎癥反應和發揮細胞毒性作用的主要機制;相反，低濃度NO可對巰基進行可逆性氧化修飾，既可以保護巰基免受不可逆性氧化，又可以調節蛋白質功能，維持細胞內環境的平衡[1]。蛋白質巰基亞硝基化是一種NO誘導的可逆性巰基氧化修飾，產物為亞硝基化蛋白質(S －nitrosated protein，PSNO)[2]。研究證實，NO 可通過亞硝基化抑制核因子κB(nuclear factor－κB，NF－κB)和活性蛋白 －1(active protein－1，AP－1)等轉錄因子的活性[3，4]，提示亞硝基化作用可以從轉錄水平調節細胞的功能和狀態。

成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast－like synoviocytes，FLS)在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)發病過程中過度增殖，在炎癥的起始和持久化以及關節破壞方面發揮重要作用[5]。在RA發病過程中，FLS中的cAMP反應元件結合蛋白 (cAMP response element binding protein，CREB)的激活是導致FLS過度增殖的重要環節[6]。抑制CREB活化成為抑制FLS增殖的關鍵。我們的前期研究發現，用NO供體直接作用于FLS的核蛋白，可引起亞硝基化修飾，并抑制白細胞介素 －1β(interleukin－1β，IL－1β)誘導的CREB的DNA結合活性，提示CREB對NO誘導的巰基氧化修飾具有敏感性[7]。亞硝基化反應與細胞內氧化還原狀態、蛋白質所處的微環境及NO濃度等多種因素有關[8]。FLS內源性生成的NO能否引起細胞內發生亞硝基化修飾，對CREB的DNA結合活性有何調節作用均未見報道。因此本實驗將對上述問題進行探討，為揭示NO在RA中的作用提供實驗依據，為RA的治療提供新的思路。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 亞硝基化谷胱甘肽(S－nitrosogluthathione，GSNO)、還原型谷胱甘肽(gluthathione，GSH)、甲基甲基硫代甲砜(methyl methanethiosulfonate，MMTS)、新亞銅樹堿(neocuproine)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、生物素化低分子量 marker、氨基胍(aminoguanidine，AG)、抗壞血酸(vitamin c，VC)均購自Sigma;N－(6－[生物素胺]己基)－3－(2－吡啶二硫)丙酰胺N－[6－(biotinamido)hexyl]－3－(2－pyridyldithio)propio namide(biotin－HPDP)為Pierce產品 ;重組白細胞介素 －1β(recombinant interleukin－1β，rIL－1β)和重組干擾素 －γ(recombinant interferon －γ，rIFN －γ)為 R＆D 產品;辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素購自北京中杉金橋生物技術有限。[γ－32P]ATP為北京亞輝生物公司產品，電泳遷移率改變分析(electrophoretic mobility shift analysis，EMSA)和CREB結合序列寡核苷酸均為Promega產品。NO測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產品。

1.2 細胞培養 大鼠成纖維細胞樣滑膜細胞(RSC－364)為北京解放軍總醫院骨病研究所黃靖香主任惠贈，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的DMEM培養基于37℃、5%CO2條件下培養。

2 方法

2.1 RSC－364細胞內蛋白質亞硝基化水平的檢測

①實驗分組 對照組:DMEM培養基中加入與實驗組等體積的生理鹽水，在37℃、5%CO2培養箱中避光孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β組:DMEM培養基中加入20 μg/L rIFN － γ 和 10 μg/L rIL －1β，37 ℃、5%CO2培養箱中避光孵育12 h。誘導型一氧化氮合酶抑制劑AG組:DMEM培養基中加入10 mmol/L AG，在37℃、5%CO2培養箱中避光孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β+AG組:DMEM培養基中加入10 mmol/L AG 后，加入 20 μg/L rIFN － γ 和 10 μg/L rIL－1β的混合物，在37℃、5%CO2培養箱中避光孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β+DTT組:DMEM培養基中加入 20 μg/L rIFN － γ 和 10 μg/L rIL －1β，37℃、5%CO2培養箱中避光孵育12 h，提取總蛋白與10 mmol/L DTT室溫避光反應15 min。各組孵育相應時間后收集細胞培養液上清進行NO含量測定，并提取總蛋白立即進行生物素轉化(biotin switch method)。

②細胞上清液中NO含量測定 按照試劑盒說明書操作。

③ 提取細胞總蛋白 細胞濃度為1×106cells/瓶，刮除法收集細胞，用預冷PBS洗滌細胞，測量細胞壓積(packed cell volume，PCV)，加入20倍 PCV 的 Hen buffer(250 mmol/L Hepes，pH 7.9，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L neocuproine，含1%NP－40)，冰浴20 min，4℃ 10000 r/min離心15 min，收集上清液用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，用Hen buffer將各組蛋白濃度調整為0.5 g/L，進行生物素轉化。以下實驗需避光操作。

④ 生物素轉化[9]原理:先將蛋白質分子中未發生亞硝基化的巰基用MMTS封閉，對發生亞硝基化的位點無明顯影響，再用還原劑VC選擇性還原亞硝基化的位點為自由巰基，最后用生物素標記自由巰基，這樣生物素就被標記在原發生亞硝基化的位點，將不穩定的亞硝基化轉化為穩定的生物素化，因此直接檢測生物素化蛋白表達水平可直接反映蛋白的亞硝基化修飾水平。方法:分別用封閉液(250 mmol/L Hepes，pH 7.9，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L neocuproine，2.5%SDS，20 mmol/L MMTS)重懸各組蛋白(蛋白濃度為0.5 g/L)，50℃反應30 min，每4 min振蕩1次。加入2倍體積冰丙酮，－20℃反應10 min，4℃ 3000 r/min離心10 min，棄上清除去多余MMTS。用Hens buffer(250 mmol/L Hepes，pH 7.9，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L neocuproine，1%SDS)重懸蛋白，加入 4 mmol/L biotin－HPDP(用 DMSO配制)和1 mmol/L VC，室溫反應1 h，每10 min振蕩1次。以上各組均設無生物素標記組為陰性對照組，無生物素標記組加相同體積DMSO。生物素標記后進行免疫印跡(Western blotting)。以下實驗不再需要避光操作。⑤Western blotting 將等體積上樣緩沖液(不含還原劑)直接加入到蛋白樣品中混勻，經10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至硝酸纖維素膜上。TBS振蕩漂洗過夜，加入辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素(抗體稀釋度為1∶200)，37℃孵育1 h。TBS振蕩漂洗后ECL顯色，Kodax X光片曝光照相。

2.2 采用電泳遷移率改變分析(electrophoresis mobility shift assay，EMSA)技術研究亞硝基化作用對CREB活性的影響

①實驗分組 對照組:DMEM培養基中加入與實驗組等體積的生理鹽水，在37℃、5%CO2培養箱中孵育12 h。rIL－1β組:DMEM培養基中加入IL－1β 10 μg/L 37℃孵箱中孵育12 h。rIL－1β+rIFN－γ組:DMEM培養基中加入10 μg/L rIL－1β和20 μg/L rIFN－γ，在37℃、5%CO2培養箱中共孵育12 h。AG組:DMEM培養基中加入10 mmol/L AG，在37℃、5%CO2培養箱中孵育12 h。AG+rIL－1β+rIFN－γ組:DMEM培養基中加入10 mmol/L AG、10 μg/L rIL－1β 和20 μg/L rIFN － γ，在37 ℃、5%CO2培養箱中共孵育12 h。rIFN－γ+rIL－1β+DTT組:DMEM培養基中加入20 μg/L rIFN－γ和10 μg/L rIL－1β，37 ℃、5%CO2培養箱中避光孵育12 h，提取核蛋白與10 mmol/L DTT室溫避光反應15 min。以上實驗均避光操作。各組于相應時點提取核蛋白進行EMSA實驗檢測CREB DNA結合活性。

②提取細胞核蛋白 刮除法收集細胞，用預冷PBS洗滌細胞后，將細胞懸液轉移入離心管內，4℃1850 r/min離心10 min，測量PCV，按文獻操作提取核蛋白[3]。用考馬斯亮藍法測定核蛋白含量。

③CREB結合序列寡核苷酸的同位素標記及純化探針 含有CREB特異性識別位點的雙鏈脫氧寡核苷酸為5’－AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG －3’，用T4多核苷酸激酶進行末端標記[γ－32P]ATP，乙醇沉淀法純化標記的寡核苷酸，具體步驟按試劑盒說明書進行。

④DNA與核蛋白的結合反應(避光操作) 取30 μg核蛋白與同位素標記的DNA探針(3.5 pmol/L)在室溫下進行結合反應30min。為了檢測CREB結合序列寡核苷酸的特異性，設立了陰性對照(反應體系中不加核蛋白提取物)、陽性對照、競爭性抑制結合(反應體系中加入未標記的CREB結合序列寡核苷酸)以及非競爭性抑制結合(反應體系中加入未標記的AP－2結合序列寡核苷酸)4個組。

⑤DNA－蛋白結合物電泳 取上述 DNA與核蛋白結合反應產物加載樣buffer混勻后，經6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(避光操作)，真空干燥凝膠，－80℃ 放射自顯影48 h，顯影后掃描至計算機中，用凝膠分析軟件對電泳譜帶進行半定量分析，取其面積與熒光強度的乘積AU(Darea·Ddensity)代表CREB的相對活性。

3 統計學處理

采用SPSS統計軟件進行統計學分析。數據用均數±標準差()表示，各組均數的比較行單因素方差分析，用最小顯著差異法作兩兩比較。

結 果

1 rIFN－γ和rIL－1β共孵育對細胞內蛋白質的亞硝基化修飾水平的影響

在標記生物素的4個組中，對照組沒有見到明顯條帶，而rIFN－γ與rIL－1β組可明顯見到1組由低分子量到高分子量的條帶，表明二者共孵育使細胞中亞硝基化修飾水平升高。如果培養液中預先加入AG可抑制rIFN－γ和rIL－1β引起的亞硝基化反應。在細胞因子作用12 h后，使提取的蛋白與DTT(巰基氧化修飾的還原劑)直接反應，可導致條帶消失，表明DTT逆轉了亞硝基化反應。各組均在分子量為39 kD和58 kD之間有弱的、吸光度一致的內源性生物素化蛋白的表達，見圖1。

Figure1.The effect of the combination stimulation of rIFN－γ and rIL－1β on NO production in RSC －364 cells.After RSC－364 cells were incubated with rIL－1β and rIFN－γ in the presence or absence of AG for 12 h，cell culture supernatant was collected to determine NO contents..n=3＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs rIL－1β+rIFN－γ group.圖1 rIFN－γ和rIL－1β共孵育對RSC－364細胞NO生成水平的影響

2 NO含量檢測結果

與對照組(4.34±2.82)μmol/L相比，細胞因子聯合孵育細胞后培養液上清中NO含量增高[(30.93±4.80)μmol/L，P ＜0.01]，而同時應用 AG可逆轉rIFN－γ與rIL－1β的作用[(4.70±2.63)μmol/L，P＜0.01]。單獨應用AG對培養液上清中NO含量無明顯影響[(5.40±2.47)μmol/L，P＞0.05]，見圖 2。

Figure2.The effect of the combination stimulation of rIFN－γ and rIL－1β on the S－nitrosylation level in RSC－364 cells.After RSC －364 cells were incubated with rIL－1β and rIFN－γ in the presence or absence of AG for 12 h，the total proteins from each group were prepared.After the reaction of the total proteins from rIL－1β +rIFN－γ group with DTT for 15 min in vitro，the total proteins from each group were subjected to the biotin switch assay，then the S－nitrosylation level was assayed by Western blotting.Molecular mass markers are shown(MM).圖2 rIFN－γ和rIL－1β共孵育對細胞內蛋白質亞硝基化修飾水平的影響

3 聯合應用細胞因子對CREB活性的影響

rIL－1β孵育細胞12 h后，CREB的 DNA結合活性明顯高于對照組(P＜0.01)。聯合應用rIL－1β和rIFN－γ 12 h后可部分抑制CREB的DNA結合活性(P＜0.01)，預先加入AG可減弱rIL－1β和rIFN－γ共孵育對CREB的DNA結合活性的抑制作用(P＜0.01)。核蛋白中加入DTT可明顯逆轉細胞因子共孵育的作用(P＜0.01)，見圖3。

討 論

Figure3.Effect of S－nitrosylation induced by rIFN－γ and rIL－1β on DNA binding activities of CREB in RSC －364 cells.Representative autoradiography picture of three experiments of EMSA..n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;△△P＜0.01 vs rIL－1β group;##P＜0.01 vs rIL－1β+rIFN －γ group.Lane 1:negative control;Lane 2:positive control;Lane 3:[32P]－labeled CREB Oligo plus unlabeled CREB(competitor);Lane 4:[32P]－labeled CREB Oligo plus unlabeled AP－2 Oligo(noncompetitor);Lane 5:control group;Lane 6:rIL－1β group;Lane 7:rIL－1β+rIFN－γ group;Lane 8:rIL－1β+rIFN－γ+DTT group;Lane 9:rIL－1β+rIFN－γ+AG group;Lane 10:AG group.圖3 rIFN－γ和rIL－1β誘導的亞硝基化反應對CREB的DNA結合活性的影響

細胞因子聯合應用可誘導細胞產生NO，但引起的生物學效應與NO的濃度有關。NO的濃度需達到靜息狀態的20倍以上，才有可能引起不可逆性巰基氧化修飾，誘導細胞凋亡[10];相反，低濃度NO可通過亞硝基化修飾調節細胞的功能和狀態[1]。因此在預實驗中我們檢測了不同濃度的rIFN－γ和rIL－1β誘導NO生成的水平，結果顯示10 μg/L rIL－1β和20 μg/L rIFN－γ誘導NO生成的量約為靜息狀態的8倍，遠遠不及能夠引起氧化損傷的水平。因此，我們選用該濃度的rIFN－γ和rIL－1β進行亞硝基化研究。結果顯示，rIFN－γ和rIL－1β共孵育可使亞硝基化修飾水平升高;而預先應用AG可抑制此效應，提示rIFN－γ和rIL－1β可通過誘導NO生成，引起亞硝基化修飾。我們還觀察到，在細胞因子孵育細胞后提取總蛋白，與DTT直接反應，幾乎看不到亞硝基化修飾。這是因為DTT能水解亞硝基化位點為自由巰基[11]，導致亞硝基化位點無法被生物素標記，因此沒有明顯條帶顯示 (圖1)。這進一步表明，細胞因子共孵育可引起細胞內亞硝基化修飾水平升高。實驗中，各組均在分子量為39kD和58kD之間有弱的內源性生物素化蛋白的表達(圖1)，這些內源性生物素化蛋白表達水平基本一致，可以作為內參來確保上樣量的一致性[7，9]。

IL－1β是活化FLS中CREB的重要炎癥介質之一[6]。我們分別用rIL－1β單獨或rIL－1β與rIFN－γ聯合孵育細胞，檢測CREB的DNA結合活性(以下簡稱活性)。結果顯示，rIL－1β單獨刺激可增強CREB的活性，rIL－1β和rIFN－γ共孵育卻可抑制CREB的活性，而預先應用AG可減弱細胞因子共孵育的作用，提示，細胞因子共孵育可通過誘導內源性NO產生，抑制CREB的活性。由于細胞因子共孵育可通過誘導內源性NO產生，引起亞硝基化修飾水平升高，因此，我們進一步探討了亞硝基化修飾水平升高對CREB活性的影響。

亞硝基化是NO衍生的氮氧化物如三氧化二氮(N2O3)直接對巰基進行氧化修飾的過程，化學反應式為:N2O3+PSH→PSNO+NO2－+H+[12]。另外，發生亞硝基化的蛋白質還可進一步與巰基反應產生分子間二硫鍵和硝?；庪x子(HNO)，化學反應式為:PSNO+PSH→PSSP+HNO[13]。因此，細胞內亞硝基化修飾水平升高可以直接引起靶蛋白發生亞硝基化(PSNO)，也可以引起靶蛋白之間形成二硫鍵(SS)。這兩種修飾均屬于NO引起的可逆性巰基氧化修飾。DTT是一種特異的巰基氧化修飾還原劑，可以還原 PSNO 或 S － S[5，6，14]。我們在細胞因子聯合孵育引起細胞內亞硝基化修飾后，提取核蛋白，與DTT直接反應，結果顯示，DTT逆轉了細胞因子共孵育對CREB活性的抑制作用。因此，我們認為細胞因子共孵育使細胞內亞硝基化修飾水平升高，導致CREB發生了可逆性巰基氧化修飾，從而抑制了CREB的活性。

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