藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞周期及凋亡的影響*

海廣范，李生瑩，崔泰震，白素平

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

藍(lán)萼香茶菜[Isodon japonica(Burm.f.)var.glaucocalyx(Maxim)Hara]為唇形科香茶菜屬植物，是毛葉香茶菜的變種，又名山蘇子，廣泛分布于我國(guó)北方。長(zhǎng)期以來，我國(guó)民間作為毛葉香茶菜用，具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性[1]。藍(lán)萼香茶菜還具有與劑量相關(guān)的心肌保護(hù)作用[2]。二萜類化合物是藍(lán)萼香茶菜的主要化學(xué)成分，研究表明藍(lán)萼香茶菜甲素具有保護(hù)肝臟、抗癌等作用[3]。藍(lán)萼香茶菜乙素也屬于二萜類化合物，本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同劑量藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)的抑制作用，探討其對(duì)AGZY細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用。

材料和方法

1 材料

1.1 AGZY細(xì)胞株 人肺腺癌細(xì)胞株(AGZY細(xì)胞株)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室凍存。AGZY細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)10%新生小牛血清、1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，培養(yǎng)瓶鋪滿時(shí)用2.5 g·L－1胰酶消化傳代，細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.2 藥品與試劑 新生牛血清(杭州四季青公司);RPMI－1640培養(yǎng)基(Gibco);胰酶(Gibco);藍(lán)萼香茶菜乙素(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提取)，經(jīng)紅外光譜、核磁共振、質(zhì)譜確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其純度為99.6%;MTT和碘化丙啶(廣州威佳生物科技有限公司)。

1.3 儀器 超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter);倒置顯微鏡 XDS－200D(Nikon Co.);CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma Co.LTD);酶標(biāo)儀(Thermo Multiskun Mk 3)。

2 方法

2.1 藍(lán)萼香茶菜乙素的配置及分組 稱取藍(lán)萼香茶菜乙素3.74 mg，加入 50 μL DMSO 溶解，用 RPMI－1640培養(yǎng)液稀釋，配置成終濃度為1 mmol/L原液(DMSO濃度為0.01%)，4℃冷藏保存。實(shí)驗(yàn)分為:對(duì)照組和用藥組，對(duì)照組用含DMSO 0.01%的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，用藥組加入藍(lán)萼香茶菜乙素，使其終濃度為 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。

2.2 MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞的存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×107cells/L，接種于96孔板中，每孔液體100 μL，細(xì)胞貼壁后傾去原液，換成含0.5%血清的RPMI－1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，加入藍(lán)萼香茶菜乙素使其濃度為 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加15 μL MTT，4 h 后傾去所有液體，加115 μL DMSO溶解，37℃靜置0.5 h，酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)，波長(zhǎng)630 nm參考。計(jì)算AGZY細(xì)胞抑制率和IC50。抑制率=(1－測(cè)定組A值/正常對(duì)照組A值)×100%。

2.3 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察 不同濃度藍(lán)萼香茶菜乙素作用細(xì)胞24 h后倒置顯微鏡下(×400)拍照。

2.4 流式細(xì)胞儀分析藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞周期及凋亡的影響 獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人AGZY細(xì)胞，PBS洗2遍，0.25% 胰蛋白酶消化，用含10% 新生牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基制備成濃度為5×108cells/L的細(xì)胞懸液，于6孔板中每孔接種2 mL。將平板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，24 h后加入不同濃度的藍(lán)萼香茶菜乙素，使其終濃度分別5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L;陰性對(duì)照組加相同體積的培養(yǎng)液。在給藥后24 h，細(xì)胞用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用70% 乙醇懸浮，在4℃冰箱固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗2遍并懸浮，加入PI染液，37℃避光溫育30 min，在流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞各期DNA量，分析細(xì)胞周期并測(cè)定凋亡率(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)630 nm)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用MTT法檢測(cè)藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果見表1。結(jié)果提示隨著藍(lán)萼香茶菜乙素劑量增加A值逐漸減小，抑制率逐漸增加，說明隨著藥物劑量的增加活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，對(duì)AGZY細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。80 μmol/L劑量組對(duì)AGZY細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì) AGZY細(xì)胞的 IC50為0.11 mmol/L。

表1 藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞的抑制作用Table1.The inhibitory effect of glaucocalyxin B on AGZY cells(.n=6)

表1 藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞的抑制作用Table1.The inhibitory effect of glaucocalyxin B on AGZY cells(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group A value Inhibitory rate(%)Control 0.59 ±0.02 0.01 ±0.005 μmol/L glaucocalyxin B 0.54 ±0.11 7.92 ±0.17*10 μmol/L glaucocalyxin B 0.49 ±0.06 16.70 ±1.23＊＊20 μmol/L glaucocalyxin B 0.46 ±0.09 21.29 ±1.40＊＊40 μmol/L glaucocalyxin B 0.43 ±0.04*25.89 ±2.06＊＊80 μmol/L glaucocalyxin B 0.28 ±0.05＊＊ 49.51 ±2.47＊＊

2 倒置顯微鏡下不同濃度藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞的影響

不同濃度藍(lán)萼香茶菜乙素作用AGZY細(xì)胞24 h后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見圖1。由圖可見陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，顆粒樣凋亡細(xì)胞少見。隨著藍(lán)萼香茶菜乙素濃度的增加，細(xì)胞顆粒樣改變數(shù)量明顯增加，20 μmol/L劑量組和40 μmol/L劑量組顆粒樣細(xì)胞清晰可見，數(shù)量顯著增加，提示細(xì)胞凋亡數(shù)目增加。80 μmol/L劑量組細(xì)胞大量死亡，正常貼壁細(xì)胞少見。

Figure1.Effect of different concentrations of glaucocalyxin B on AGZY cells.A:control group;B:5 μmol/L glaucocalyxin B － treated AGZY cells for 24 h;C:10 μmol/L glaucocalyxin B － treated AGZY cells for 24 h;D:20 μmol/L glaucocalyxin B － treated AGZY cells for 24 h;E:40 μmol/L glaucocalyxin B －treated AGZY cells for 24 h;F:80 μmol/L glaucocalyxin B －treated AGZY cells for 24 h.圖1 不同濃度藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞的影響

3 藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞周期和凋亡率的影響

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率，見表2。陰性對(duì)照組AGZY細(xì)胞分布于各個(gè)細(xì)胞周期。藍(lán)萼香茶菜乙素各劑量組隨著藥物劑量的增加G2/M期細(xì)胞比例顯著減少，呈現(xiàn)一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系。其中20 μmol/L劑量組、40 μmol/L劑量組和80 μmol/L劑量組與陰性對(duì)照組相比有顯著差異。表明藍(lán)萼香茶菜乙素具有抑制AGZY細(xì)胞向G2/M期移行的作用。AGZY細(xì)胞的凋亡率也隨著藍(lán)萼香茶菜乙素劑量的增加而增加，提示藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞凋亡的影響也呈現(xiàn)一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系。

表2 藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞周期和凋亡率的影響Table2.Effect of glaucocalyxin B on cell cycle and apoptotic rates of AGZY cells(.n=6)

表2 藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞周期和凋亡率的影響Table2.Effect of glaucocalyxin B on cell cycle and apoptotic rates of AGZY cells(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group G0/G1(%) S(%) G2/M(%)Apoptotic rate(%)Control 67.91 ±4.3619.27±1.58 13.01 ±1.49 1.19 ±0.025 μmol/L glaucocalyxin B 61.65 ±3.2926.43±1.21 11.05 ±1.32 7.23 ±1.05*10 μmol/L glaucocalyxin B 68.07 ±2.9623.77±2.09 8.45 ±1.20 9.76 ±1.62*20 μmol/L glaucocalyxin B 71.15 ±3.4720.94 ±3.65 7.95 ±1.36*16.58 ±2.01＊＊40 μmol/L glaucocalyxin B 76.32 ±4.0819.68±1.39 2.05 ±0.09＊＊29.75 ±3.40＊＊80 μmol/L glaucocalyxin B 79.87 ±1.2619.72±0.94 0.98 ±0.01＊＊41.39 ±2.17＊＊

討 論

藍(lán)萼香茶菜乙素是從藍(lán)萼香茶菜中提取的二萜類化合物，其結(jié)構(gòu)與藍(lán)萼香茶菜甲素相似，是藍(lán)萼香茶菜甲素的14－乙酰化物，把兩者分別乙酰化，可以得到相同的乙酰化物。研究表明藍(lán)萼香茶菜甲素具有保護(hù)心肌、改善微循環(huán)[4，5]等作用，但藍(lán)萼香茶菜乙素的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同劑量藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞的作用，研究其對(duì)人肺腺癌細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種自然生理學(xué)過程，指在一定生理或者病理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)特定基因操縱、調(diào)控的細(xì)胞死亡方式，因此也被稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。細(xì)胞凋亡典型的形態(tài)學(xué)特征為:細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體(apoptotic bodies)，形成顆粒樣外觀。多數(shù)植物性抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞都具有一定的抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，因此，細(xì)胞凋亡調(diào)控異常在惡性腫瘤的發(fā)展過程中具有非常重要的意義，腫瘤防治的關(guān)鍵是抑制細(xì)胞的增殖和/或促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[6，7]。

本實(shí)驗(yàn)MTT法檢測(cè)結(jié)果提示藍(lán)萼香茶菜乙素5 μmol/L劑量組、10 μmol/L 劑量組、20 μmol/L 劑量組、40 μmol/L 劑量組和80 μmol/L劑量組均能夠不同程度抑制人肺腺癌細(xì)胞(AGZY細(xì)胞)的生長(zhǎng)和增殖，且呈現(xiàn)一定得劑量－效應(yīng)關(guān)系。其中以40 μmol/L劑量組和80 μmol/L劑量組抑制作用最為顯著。藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)AGZY細(xì)胞的IC50值為0.11 mmol/L。細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果提示:不同濃度的藍(lán)萼香茶菜乙素均可使AGZY細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒樣外觀，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡特征，這種特征在20 μmol/L劑量組和40 μmol/L劑量組較為明顯。流式細(xì)胞儀檢測(cè)AGZY細(xì)胞周期和凋亡率結(jié)果也顯示:藍(lán)萼香茶菜乙素 20 μmol/L 劑量組、40 μmol/L 劑量組和 80 μmol/L劑量組可以抑制AGZY細(xì)胞向G2/M期的移行，抑制細(xì)胞的分裂和增殖;不同劑量的藍(lán)萼香茶菜乙素均可導(dǎo)致AGZY細(xì)胞不同程度的凋亡，細(xì)胞凋亡率隨著藥物劑量的增加凋亡率也逐漸增加，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。鑒此可以初步判斷藍(lán)萼香茶菜乙素可以通過阻滯AGZY細(xì)胞向G2/M期的移行而發(fā)揮對(duì)其生長(zhǎng)抑制和促使細(xì)胞凋亡的作用

綜上所述，藍(lán)萼香茶菜乙素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞AGZY具有一定的抗腫瘤活性，可通過改變細(xì)胞周期來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。有關(guān)藍(lán)萼香茶菜乙素改變細(xì)胞周期誘導(dǎo)凋亡的具體作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

[1]孫漢董，許云龍，姜 北.香茶菜屬植物二萜化合物[M].第1版.北京:科學(xué)出版社，2001.2－3.

[2]劉蘭娣，葉麗卡，潘東軍，等.藍(lán)萼香茶菜對(duì)大鼠全心缺血再灌注時(shí)心肌c－fos基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2003，28(4):358－361.

[3]孫 駿，郭 莉，莊 煒，等.我國(guó)藥用香茶菜屬植物化學(xué)及藥理學(xué)研究新進(jìn)展[J].中草藥，2002，33(8):3－4.

[4]張 濱，龍 昆.藍(lán)萼甲素對(duì)兔血小板聚集及cAMP含量的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1993，14(4):346－350.

[5]張 濱，龍 昆，姜元英，等.藍(lán)萼甲素對(duì)兔血小板生成血小板活化因子及花生四烯酸代謝的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1992，6(1):52－54.

[6]蔣 振，郭俊明，肖丙秀.特異性微小RNA抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2009，25(9):1726－1730.

[7]Ohata M，Koyama Y，Suzuki T，et al.Effects of tea constituents on cell cycle progression of human leukemia U 937 cells[J].Biomed Res，2005，26(1):1 －7.