核黃素對STZ誘導的大鼠糖尿病腎病的治療作用

王國光，張 翠，陸曉華，李 偉

(皖南醫學院病理生理教研室，安徽 蕪湖 241000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病重要的并發癥之一，始于糖尿病發病之初，血糖達到糖尿病診斷標準后DN即開始[1]，是危及病人生命的主要原因。DN早期的主要病理特征是腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜增厚及系膜區細胞外基質的進行性積聚;后期為腎小球、腎小管間質的纖維化，最終導致蛋白尿和腎功能衰竭。DN的發病機制較復雜，目前認為高血糖、氧化應激[2，4]、糖基化末端產物[3]、高胰島素和血脂異常等在DN的發生過程中起著非常重要的作用。越來越多的證據表明，糖尿病引起的氧化應激是導致糖尿病慢性并發癥的最根本原因之一[4，5]。因此，許多具有抗氧化作用及提高機體抗氧化能力的藥物被用于治療DN[6，7]。

近年來，越來越多的研究證據表明轉化生長因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)在 DN的發病機制中占有重要地位，TGF－β可能為DN發病機制的最后共同通路[8]，在高血糖狀態下，有多種生化異常及微循環障礙共同參與DN的發生發展，包括蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活、蛋白非酶糖化作用、氧化應激、腎素－血管緊張素系統活性增加等，它們可通過各種途徑參與TGF－β的調節，導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)積聚及腎小球硬化。TGF－β1引起的纖溶酶原活化抑制因子－1(plasminogen activator inhibitor－1，PAI－1)mRNA及蛋白的表達增加和纖維蛋白溶酶活性的降低，進而使ECM沉積增多。

核黃素又稱維生素B，它是動物體內參與碳水化合物、蛋白質和脂肪代謝的許多酶的組成部分。并作為抗氧化維生素之一，在動物的抗氧化體系中起著重要作用[9，10]。本研究旨在探討核黃素對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的大鼠DN的保護作用，研究核黃素對TGF－β1和PAI－1表達的影響，初步研究核黃素對糖尿病大鼠腎臟的保護機制。

材料和方法

1 動物

雄性 Sprague－Dawley大鼠36只，體重180－220 g，購自南京青龍山動物養殖場。

2 主要試劑

STZ購自 Sigma;兔抗鼠 TGF－β1、PAI－1多克隆抗體購自武漢Boster公司;硝酸纖維素膜、堿性磷酸酶標記的Ⅱ抗、葡萄糖檢測試劑盒等購自合肥博美生物公司;核黃素購自上海化學試劑采購供應站分裝廠;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、考馬斯亮藍法檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

3 動物分組及模型的制備

大鼠自由飲水、進食。將大鼠隨機分為3組:正常對照組(normal control，NC)、糖尿病模型組(diabetic model，DM)、核黃素治療組(DM+riboflavin，RB)，每組10只。適應性喂養1周，禁食12 h，腹腔注射STZ 65 mg/kg(溶于0.1%pH4.5的無菌檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液)，正常對照組注射無菌檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液，48 h尾靜脈空腹采血測血糖，血糖值≥13.8 mmol/L的大鼠為糖尿病模型組。造模后分組喂養，處理如下:正常對照組和模型組大鼠以正常飼料喂養，核黃素組大鼠輔以核黃素喂養，20 mg/d。各組實驗大鼠于8周后，大鼠處死前1 d代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量，麻醉，頸動脈取血，分離血清，切取腎臟，用濾紙吸干后稱重，一側腎臟置－80℃冰箱保存供Western blotting檢測用，部分腎臟以10%中性甲醛固定，做病理檢查。

4 組織形態學觀察

腎組織標本經10%中性甲醛溶液固定，常規梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成厚4 μm石蠟切片，行HE染色，在光鏡下觀察腎組織形態學改變。

5 生化指標的檢測

考馬斯亮藍法測尿蛋白。取－80℃保存的各組腎皮質組織勻漿，測定SOD、CAT的活性及MDA的含量，測定血清SOD、CAT活性，測定均嚴格按照試劑盒說明書操作。

6 Western blotting檢測

取－80℃保存的各組腎皮質組織，勻漿、離心后，標定上清液蛋白濃度上樣，經12%SDS－PAGE電泳分離，將目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉，TBST沖洗后加兔抗鼠TGF－β1、PAI－1Ⅰ抗，4℃孵育過夜。TBST液沖洗，加堿性磷酸酶標記的Ⅱ抗孵育，洗膜后NBT/BCIP顯色。

7 統計學處理

結 果

1 大鼠的一般狀況

注射STZ誘導糖尿病后，大鼠逐漸出現多飲、多食、多尿等典型的糖尿病表現，相應的對照組大鼠食量、飲水、尿量及精神狀態基本正常，體重明顯增加。經喂以核黃素，大鼠的飲水、食量和尿量有較明顯的改善。

2 核黃素對尿蛋白及腎臟臟器系數的影響

實驗結束時，檢測到糖尿病組大鼠24 h尿蛋白量明顯高于正常對照組(P＜0.01)，見表1，輔以核黃素喂養的糖尿病大鼠尿蛋白量較糖尿病組明顯減少(P＜0.01)，見表1。由表中1可見，糖尿病組大鼠體重下降，腎臟臟器系數增大，與正常組比較有顯著差異(P＜0.01);核黃素治療組大鼠體重及腎臟臟器系數較糖尿病組均有所改善，腎臟臟器系數明顯降低(P＜0.01)。

表1 核黃素對尿蛋白及腎臟臟器系數的影響Table1.Effects of riboflavin on the content of protein in urine and the ratio of kidney and body weight(.n=10)

表1 核黃素對尿蛋白及腎臟臟器系數的影響Table1.Effects of riboflavin on the content of protein in urine and the ratio of kidney and body weight(.n=10)

##P ＜0.01 vs normal control;＊＊P ＜0.01 vs diabetic model.

Group Urinary protein(mg) Kidney weight(g) Body weight(kg) KW/BW(mg/g)Normal control 5.75 ±1.81 2.21 ±0.37 405.50 ±21.64 5.45 ±0.91 Diabetic model(DM) 39.92 ±8.57## 2.17 ±0.34 168.38 ±16.61## 13.02 ±2.40##DM+riboflavin 19.92 ±4.77＊＊ 2.06 ±0.18 281.24 ±27.05＊＊ 7.39 ±0.97＊＊

3 各組大鼠血清SOD、CAT活性變化

與正常對照組比較，糖尿病組大鼠血清的SOD、CAT活性明顯降低(P＜0.01)，見圖1，顯示大鼠的抗自由基能力下降;而核黃素治療組大鼠的SOD、CAT活性較糖尿病組有顯著提高(P＜0.01)，見圖1，表明大鼠機體的抗氧化能力有所提高。

Figure1.Effects of riboflavin on the activities of SOD and CAT in serum.NC:normal control;DM:diabetic model;RB:DM+riboflavin..n=10.##P＜0.01 vs NC;＊＊P ＜0.01 vs DM.圖1 核黃素對血清SOD、CAT活性的影響

4 腎組織的抗氧化酶活性變化

糖尿病大鼠腎組織中抗氧化酶SOD、CAT活性較對照組明顯降低(P＜0.01)，見表2，與此相應，MDA含量明顯升高(P＜0.01)，見表2，表明組織抗氧化作用下降;核黃素組大鼠腎組織SOD、CAT活性較糖尿病組顯著提高，MDA含量明顯降低(P＜0.01)，見表2，顯示經核黃素治療，糖尿病大鼠腎組織抗氧化作用有所改善。

表2 核黃素對SOD、CAT活性及MDA含量的影響Table2.Effects of riboflavin on the activities of SOD，CAT，and the content of MDA in the kidney(.n=10)

表2 核黃素對SOD、CAT活性及MDA含量的影響Table2.Effects of riboflavin on the activities of SOD，CAT，and the content of MDA in the kidney(.n=10)

##P ＜0.01 vs normal control;＊＊P ＜0.01 vs diabetic model.

SOD CAT MDA Group (U/g protein) (U/g protein) (mol/g protein)Normal control 2.36 ±0.44 11.94 ±1.14 306.5 ±39.8 Diabetic model(DM)0.38 ±0.07## 3.05 ±0.55## 637.9 ±76.1##DM+riboflavin 1.24 ±0.23＊＊ 5.86 ±1.08＊＊ 441.1 ±39.5＊＊

5 Western blotting檢測結果

糖尿病組和核黃素治療組大鼠腎臟皮質都檢測到TGF－β1、PAI－1蛋白的表達，核黃素治療組大鼠腎皮質中TGF－β1和PAI－1的表達均明顯低于糖尿病模型組，見圖2。

Figure2.Effects of riboflavin on TGF－β1and PAI－1 in kidney.DM:diabetic model;RB:DM+ribofavin..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DM.圖2 核黃素對腎組織TGF－β1和 PAI－1的影響

6 腎組織形態學改變

糖尿病組大鼠腎小球明顯充血水腫，體積增大，腎小管上皮細胞變性壞死脫落，基底膜破壞，部分結構不清。核黃素治療組大鼠腎臟只有較輕微的充血，管腔分開，基底膜完整，結構清晰，腎小球和腎小管結構接近正常，見圖3。

討 論

DN是糖尿病中發病率較高的慢性并發癥，也是終末期腎衰竭(end stage renal disease，ESRD)及糖尿病病死率增加的重要因素[11]。已成為當前醫學界重點研究課題。

研究顯示，DN的發生、發展與氧化應激密切相關。近年研究表明持續的高血糖引起的腎血流動力學改變、糖代謝異常伴蛋白及脂代謝異常是DN病變的基礎，細胞因子被激活是DN病變的直接機制，氧化應激是它們的共同機制[4，12]。我們推測作為抗氧化維生素之一的核黃素對DN可能具有保護作用。本實驗，我們以核黃素喂養糖尿病大鼠對其進行一段時間的治療，檢測大鼠24 h尿蛋白量、腎臟臟器指數均低于糖尿病大鼠，表明經治療后的大鼠腎臟損傷減輕。本實驗研究結果提示核黃素可減輕或延緩DN的發生發展，對糖尿病腎臟具有一定的保護作用。

Figure3.Kidney pathology of rats from NC，DM，RB groups(HE，×400).NC:normal control;DM:diabetic model;RB:DM+riboflavin.圖3 NC、DM、RB組腎組織病理比較

在本研究，我們對大鼠血清和腎皮質組織中抗氧化酶SOD和CAT活性的檢測發現，經核黃素治療，糖尿病大鼠的抗氧化酶SOD和CAT活性有明顯的提高，提示核黃素能夠改善STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟的抗氧化能力，與在腎組織中檢測的過氧化產物丙二醛的含量相一致。表明核黃素可能是通過提高抗氧化、抗炎能力的機制保護糖尿病大鼠腎臟。

DN在病理上主要表現為腎臟肥大、基底膜增厚及腎小球和腎小管間質細胞外基質(ECM)進行性積聚[13]，在這一過程中，TGF － β1、PAI－1 參與并發揮重要作用。TGF－β1是一種強效的致纖維化因子，是DN發展過程中的核心因子[8]。糖尿病的重要表現是高血糖，高糖可激活PKC，導致TGF－β1表達升高[8]，促使腎臟細胞發生細胞肥大、增加系膜細胞胞外基質的產生、并通過增加基質降解酶抑制物活性，抑制基質降解酶合成而減少細胞外基質的降解，從而加速DN的發生發展，造成腎臟的持續損害。

PAI－1主要由血管內皮細胞合成，可抑制纖溶酶原的活化，降低ECM的降解，促進組織ECM的積聚，加速DN的發生。研究發現高糖、TGF－β1和由糖氧化酶產生的過氧化氫能上調PAI－1 mRNA及蛋白的表達，同時顯著抑制纖維蛋白溶酶活性，抗氧化劑能抑制這種作用[14，15]。PAI－1 的表達與糖尿病患者腎損害(蛋白尿)的程度呈正相關。通過基因轉染技術使PAI－1基因在腎臟中定位表達，結果顯示，隨PAI－1表達水平增加，局部出現ECM過度積聚[11]，在腎小球纖維化區域也可檢測出 PAI－1表達增高。以上表明 PAI－1是引起腎臟損傷的重要物質。另有研究證實，腎臟局部TGF－β1增加時，PAI－1的合成增加，PA的活性降低，基質中PAI－1的沉積增多。用抗TGF－β1的抗體可阻斷PAI－1的增加[15]。因此，一定程度上抑制糖尿病腎臟TGF－β1、PAI－1的表達可以減輕糖尿病腎臟的損傷。

本研究Western blotting結果顯示，糖尿病大鼠經核黃素治療后，腎皮質TGF－β1蛋白及PAI－1蛋白表達明顯降低，提示核黃素可能通過提高機體的抗氧化能力抑制腎組織TGF－β1、PAI－1蛋白表達，減輕糖尿病腎臟損傷。核黃素具有明顯的抗氧化作用[10]，本研究也證明核黃素可提高STZ誘導的糖尿病大鼠的抗氧化能力，提示核黃素對DN的保護作用機制可能是通過提高機體的抗氧化性，抑制腎皮質TGF－β1蛋白及PAI－1蛋白表達，使腎小管間質細胞外基質減少，或降解相對增多，從而減輕或延緩DN的發生發展。

[1]向紅丁.糖尿病腎病的預防措施[J].臨床內科雜志，2005，22(3):147 －149.

[2]李曉博，牟忠卿，陳 麗，等.糖尿病大鼠腎臟組織氧化應激及其在糖尿病腎病發病中的意義[J].中國病理生理雜志，2006，22(4):806 －809.

[3]Suzuki D，Toyoda M，Yamamoto N，et al.Relationship between the expression of advanced glycation end－products(AGE)and the receptor for AGE(RAGE)mRNA in diabetic nephropathy[J].Intern Med，2006，45(7):435 －441.

[4]Evans JL，Goldfine D，Maddux BA，et al.Oxidative stress and stress－actived signaling pathways:a unifying hypothesis of type 2 diabetes[J].Endocr Rev，2002，23(5):599－622.

[5]舒 冏，曾龍驛，林可意，等.伊貝沙坦聯合舒洛地特對糖尿病大鼠腎臟協同保護作用的研究[J].中國病理生理雜志，2009，25(2):361 －366.

[6]Naito Y，Uchiyama K，Aoi W，et al.Prevention of diabetic nephropathy by treatment with astaxanthin in diatetic db/db mice[J].Bifactors，2004，20(1):49 －59.

[7]Onozato ML，Tojo A，Goto A，et al.Radical scavenging effect of gliclazide in diabetic rats fed with a high cholesterol diet[J].Kidney Int，2004，65(3):951 － 960.

[8]Bernd H，Christoph D，Birgit H，et al.Correlation of enhanced thrombospondin－1 expression，TGF－β signalling and proteinuria in human type － 2 diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant，2008，23(12):3880 －3887.

[9]Dutta P，Serafi J，Halpin D，et al.Acute ethanol exposure alters hepatic glutathione metabolism in riboflavin deficiency[J].Alcohol，1995，12(1):43 －47.

[10]Higashi－Okai K，Nagino H，Yamada K，et al.Antioxidant and prooxidant activities of B group vitamins in lipid peroxidation[J].UOEH，2006，28(4):359 －368.

[11]Groop PH.The presence and severity of chronic kidney disease predicts all－cause mortality in type 1 diabetes[J].Diabetes，2009，58(6):1651 －1658.

[12]Kang D，Hamasaki N.Mitochondrial oxidative stress and mitochondrial DNA[J].Clin Chem Lab Med，2003，41(10):1281－1288.

[13]Wolf G，Ziyadeh FN.Molecular mechanisms of diabetic renal hypertrophy[J].Kidney Int，1999，56(2):393 －405.

[14]Hirano T，Kashiwazaki K，Moritomo Y，et al.Albuminuria is directly associated with increased plasma PAI－1 and factor V levels in NIDDM patients[J].Diabetes Res Clin Pract，1997，37(1):11 －23.

[15]Yang C，Patel K，Harding P，et al.Regulation of TGF－β1/MAPK －mediated PAI－1 gene expression by the actin cytoskeleton in human mesangial cells[J].Exp Cell Res，2007，313(6):1240－1250.